Jak powiedział Picasso: „Dobrzy artyści kopiują, wielcy kradną.” Podobnie wyrażali się między innymi: Igor Stravinsky, T.S. Eliot czy Steve Jobs.

Te słowa nie są jednak pochwałą kradzieży, ale zachętą do pokory i szacunku wobec tych, którzy tworzyli coś wcześniej. Zachętą do przyznania, że coś stworzone wcześniej było co najmniej inspiracją dla kolejnych pokoleń artystów. Przykładem jest las Birnam z Makbeta Szekspira, który inspirował Tolkiena przy opisie ataku Entów (pasterzy drzew) na Isengard.

Czy biotechnolodzy kradną (plagiatują) w takim sensie? Podobnie, jak artyści obserwują efekty pracy innych artystów, również biotechnolodzy obserwują pracę innych biotechnologów. Pojęcie „patentów” w sztuce (poza muzyką) bywa trudne do zdefiniowania – nie patentuje się obrazów. W biotechnologii jest o patenty trochę łatwiej. Mimo to urzędy patentowe ze zmienną konsekwencją przyznają lub nie prawa patentowe (własności intelektualnej) kolejnym projektantom. Jednak biotechnolodzy i artyści „plagiatują” jeszcze inaczej. „Plagiatują” naturę, a ta nie pójdzie oczywiście do sądu. Okazuje się jednak, że ma ona swoich rzeczników w urzędach patentowych w kwestiach biotechnologicznych. Przez wiele lat w urzędach patentowych trwał wielki spór o to, na ile rozwiązania podpatrzone w naturze mogą być patentowane. Rzecznicy patentowi wyznaczyli pewne kryteria, po spełnieniu których patent zostanie przyznany. Natomiast, biorąc pod uwagę cytat z Picassa, wobec kogo czy czego taki „złodziej biotechnolog” powinien taki rodzaj szacunku okazać?

Przeciwciała, enzymy do testów PCR, plazmidy, wektory wirusowe, nagrodzony Noblem CRISPR, promotory, sekwencje nukleotydowe czy aminokwasowe i wiele innych „rzeczy”, „ukradli” wirusom i bakteriom (na końcu tekstu znajduje się glosariusz wyjaśniający używane terminy biotechnologiczne). Po co…? Wcześniej chociażby po to, by produkować białka terapeutyczne i diagnostyczne. Ostatnio wszystko to, czego trochę nakradli, składają jak klocki lego w zupełnie nowe twory terapeutyczne, nazywając to już nie biotechnologią, a biologią syntetyczną.

Plazmidy służą bakteriom do tworzenia np. białek antybiotykooporności. Biotechnolodzy zamienili te fragmenty DNA w plazmidach w transgeny do produkcji białek potrzebnych ludziom – chociażby do produkcji insuliny dla chorych na cukrzycę. Nie dość, że ukradli bakteriom pomysł, to jeszcze go wykorzystują do produkcji np. leków.

Polimerazowa reakcja łańcuchowa (PCR), która stała się powszechnie znana w czasie pandemii COVID-19, to również w pewnym sensie zasługa bakterii. Jedne z nich, aby żyć w gorących źródłach Yellowstone „wymyśliły” białka, w tym polimerazę, które są w stanie przetrwać w wysokich temperaturach, a to dzięki niej możliwe jest szybkie prowadzenie PCR. W czasie tej reakcji temperatura wielokrotnie osiąga ponad 90 stopni Celsjusza, a większość molekuł polimerazy nie może ulec denaturacji. Oczywiście biotechnolodzy – za pomocą plazmidów z transgenem – zmuszają zwykłe bakterie (głównie E.coli) do produkcji tej polimerazy. Kradną polimerazę z jednych bakterii, a inne zmuszają do niewolniczej produkcji.

Skąd się wzięła odwrotna transkryptaza potrzebna, aby przepisać RNA (wirusa takiego jak SARS-CoV-2) na DNA przed reakcją PCR? Również ona została „skradziona”, tym razem wirusom.

Technologia CRISPR, nagrodzona nagrodą Nobla w 2020 roku, służąca obecnie np. do naprawy uszkodzonych genów, wywodzi się z systemu bakteryjnego, którym bakterie zwalczają swoich wrogów, wirusy bakteryjne – bakteriofagi. Pierwsza terapia oparta o CRISPR do leczenia osób z chorobą genetyczną – chorobą sierpowatokrwinkową – została zarejestrowana przez FDA w 2023 roku. System, z którego wywodzi się CRISPR/Cas chroni bakterie przed ich wirusami – to „element układu odpornościowego bakterii”. Bakterie tworzą „biblioteki” fragmentów genomów fagowych, aby wtedy, kiedy któryś znowu zaatakuje, zniszczyć go. Tworzenie bibliotek fragmentów genomów fagowych w genomie bakteryjnym jest więc przez niektórych autorów określane mianem budowania pamięci immunologicznej. Natomiast biotechnolodzy wykorzystują CRISPR/Cas do naprawy genomu np. w ludzkich komórkach. Widać więc, że podpatrywanie natury miało miejsce, ale zastosowanie rozwiązania Cas9 z zaprojektowanym fragmentem RNA jest już zupełnie inne. Powstają kolejne metody edycji genomu, takie jak prime editing, w których podkrada się naturze coraz więcej. Nie wolno robić edycji genomu na poziomie komórek linii germinalnych czy komórek zarodkowych człowieka, ale wolno na poziomie komórek somatycznych (dojrzałych i multipotentnych macierzystych).

Rycina 1 Schemat odwzorowuje działanie systemu edycji genomu PE. Chimeryczne białko składa się ze zmutowanego Cas9 i odwrotnej transkryptazy. Mutacja Cas9 powoduje, że enzym rozcina tylko jedną nić dwuniciowego DNA. Odwrotna transkryptaza przepisuje sgRNA na DNA, które jest wykorzystywane przez system naprawy uszkodzeń DNA. Genom jest zmieniany zgodnie z instrukcją dostarczaną przez pegRNA (odmiana gRNA stosowana do edycji prime). Na podstawie ryciny z artykułu “Techniki edycji genomu jako narzędzie modyfikacji komórek układu odpornościowego” Alergologia Polska 2021 (za zgodą autorów Ewelina Stoczyńska-Fidelus, Piotr Rieske)

Biotechnolodzy równocześnie próbują wykorzystać również naturalnego wroga bakterii, jakim są bakteriofagi, po to, żeby bakterie zwalczać. Jest to szczególnie ważne wobec pojawiającej się antybiotykoodporności. Rozwiązanie takie zaczyna być stosowane w produkcji żywności, ponieważ stosowanie antybiotyków chociażby w uprawach roślin czy hodowli drobiu to jedna z głównych przyczyn pojawiania się antybiotykoodporności.

Jak widać, bardzo wiele systemów wykorzystywanych przez biotechnologów powstało w trakcie walki organizmów z ich patogenami. Co nie powinno dziwić, bo taka walka jest akceleratorem ewolucji, a zatem tworzenia coraz doskonalszych rozwiązań.

Nie jest to jednak jedyne źródło, z którego pozyskuje się narzędzia czy technologie.

Biotechnolodzy wykorzystują bakterie (np. Agrobacterium tumefaciens), aby tworzyć rośliny GMO. Normalnie bakterie te infekują rośliny i wprowadzają swoje geny, żeby pozyskiwać od roślin opiny.

Wektory wirusowe stosowane np. w terapii genowej to wykorzystanie ułomnych czynników infekcyjnych, które w formie kompletnej infekują np. komórki ludzi, a u biotechnologów infekują komórki, aby wprowadzić do nich to, co chcą w nich umieścić. Jeśli chcemy zastosować wspomniany wcześniej CRISPR/Cas, to także najczęściej wykorzystujemy wirusy jako wektory tego systemu. Jeśli chce się wprowadzić „transgen leczniczy”, to również tak to się odbywa.

Bakterie, aby walczyć z bakteriofagami, „wymyśliły” – podobnie (jak CRISPR/Cas) – enzymy restrykcyjne. Biotechnolodzy korzystają z nich notorycznie, aby tworzyć wektory do produkcji np. białek leczniczych. Paradoksalnie system, który miał chronić bakterie przed ingerencją w ich DNA, służy do zmieniania ich DNA plazmidowego.

Bakteriofagi posiadają natomiast specjalne rekombinazy, umożliwiające wprowadzanie ich genów do genomu bakterii. Biotechnolodzy zastąpili tym systemem fagowym enzymy restrykcyjne, aby skonstruować/wygenerować system gate way – bramkowania − i szybciej przenosić między plazmidami np. transgeny lecznicze.

Biotechnolodzy w ogóle bardzo często korzystają z rozwiązań powstających w trakcie ewolucji wirusów. Genomy wirusów są bardzo małe, gdyż od upakowania na małej przestrzeni wielu informacji zależy ich przetrwanie. Biotechnolodzy również muszą upakowywać dużo informacji na małej przestrzeni, co wynika z niuansów technicznych ich pracy.

Wirusy „wymyśliły” więc np. sekwencję IRES, która pozwala otrzymywać z jednego fragmentu mRNA coś, co u eukariotów jest kodowane przez kilka genów. Wirusy geny zastąpiły czymś, co nazywa się otwartymi ramkami odczytu. Nie ma potrzeby, żeby kontrolować pojawianie się białek wirusowych w tak skomplikowany sposób, jak np. w komórkach człowieka. Zazwyczaj wszystkie białka wirusowe mogą, a nawet powinny pojawiać się równocześnie, aby doszło do samoskładania wirionów. W przypadku komórek człowieka tak nie jest. Istnieje wąska specjalizacja. To między innymi dzięki temu, pomimo że w każdej komórce jednego człowieka jest w zasadzie ten sam genom, mamy ponad 200 rodzajów komórek.

Podobnie jak IRES, peptydy (sekwencje) F2A czy P2A pozwalają wirusom na tworzenie wielu białek z jednej cząsteczki mRNA. Biotechnolodzy „plagiatują” te rozwiązania, aby również otrzymywać kilka białek z jednego fragmentu RNA. W tym przypadku rybosom po zakończeniu translacji jednego białka przeskakuje niejako do translacji następnego. IRES pozwala przyłączać się rybosomom w kilku miejscach mRNA i inicjować translację.

Wirusy regulują transkrypcję (przepisywanie DNA na RNA) za pomocą bardzo małych fragmentów regulacyjnych i w ten sposób wymuszają produkcję swojego RNA w komórkach ssaków. Te małe elementy regulacyjne z wirusów SV-40 czy CMV również zostały wykorzystane przez biotechnologów.

Oczywiście nie wyczerpuje to wszystkich elementów, które są plagiatowane z organizmów żywych przez biotechnologów.

Ponadto nie wszystkie rozwiązania pochodzą ze świata patogenów.

Przeciwciała wykorzystywane np. w diagnostyce normalnie służą do zwalczania patogenów. Biotechnolodzy wytwarzają je do: testów onkologicznych, wirusowych (kupujemy je w aptece), a nawet do testów ciążowych. To rozwiązanie układu odpornościowego różnych zwierząt. Ostatnio plagiatują je np. od alpak, ale również od rekinów, gdyż te mają dość sprytne (bardzo małe) przeciwciała.

Szczepionki to również zaprzęgnięcie do działań człowieka naturalnego systemu odpornościowego. Do ich tworzenia wykorzystywane są plazmidy, wektory wirusowe itp., opisane wcześniej. W naturze cena nabywania odporności jest bardzo wysoka. Często jest to kalectwo, niekiedy śmierć członków społeczności.

Przeciwnowotworowa terapia CAR-T jest wspólnym dziełem natury, biotechnologów i immunologów. Polega na połączeniu odpowiedzi limfocytów T i limfocytów B. Skradziono więc układowi odpornościowemu dwa rozwiązania i stworzono ich funkcyjną chimerę przy okazji tworzenia chimerowego białka. Powstała komórka, która nie wymaga prezentowania antygenu na cząsteczkach HLA (MHC), ale rozpoznająca go bezpośrednio. Pozwala to uniknąć niektórych działań, komórek nowotworowych, których one dokonują, aby „zmylić” układ odpornościowy. Litera C w nazwie CAR-T pochodzi właśnie od chimerowy (ang. chimeric).

CAR-T to przykład nowego świata biotechnologii, czyli biologii syntetycznej. W tym świecie biotechnolodzy tworzą nowe byty np. komórkowe, ale również kradną istniejące w przyrodzie elementy regulatorowe, białka itp. Również białka używane do edycji (naprawiania) genów w ramach metod nowocześniejszych niż CRISPR, takich jak prime editing, to białka chimerowe. Podbieranie elementów ze świata przyrody to pierwszy etap. Kolejny − to tworzenie z nich nowych, nieistniejących w przyrodzie bytów, takich jak komórki. Układy te są na tyle skomplikowane, że zaczyna się je porównywać do układów scalonych. Jest to dość luźna analogia, ponieważ komórka ma inną organizację przestrzenną niż układ scalony, ale obrazuje złożoność zmian, które biologia syntetyczna oferuje.

Na czym więc bardzo często polega biotechnologia czy biologia syntetyczna? Polega na podpatrywaniu natury i wykorzystywaniu jej wynalazków w innych celach niż te, dla których natura je wytworzyła. Sposoby korzystania z tych wytworów stają się coraz bardziej wyrafinowane. Najczęściej korzysta się z tego, co powstało w ramach ewolucyjnego wyścigu zbrojeń między bakteriofagami, a bakteriami, czy między naszym układem odpornościowym, a patogenami.

Rycina 2 Opis CAR-T w glosariuszu. W skrócie: komórki CAR-T atakują komórki nowotworowe i prowadzą do ich śmierci. CAR-T otrzymuje się dzięki metodom inżynierii genetycznej. W tym celu wykorzystuje się rozwiązania opisane w tekście: wektory wirusowe, transgen, którego transkrypcja regulowana jest np. promotorem CMV itp. Zmodyfikowane na podstawie materiału z BPS Bioscience CAR-T Cell Therapy (bpsbioscience.com).

Glosariusz z wyjaśnieniami ( w celach popularyzacji)

PCR − łańcuchowa reakcja polimerazy, PCR (od ang. polymerase chain reaction)

Metoda powielania dwuniciowych fragmentów DNA. W trakcie reakcji odbywa się od 25 do 40 cykli, w czasie których dochodzi do kopiowania wybranego fragmentu DNA temperatura zmienia się od 45 do 95 stopni Celsjusza.

Odwrotna transkryptaza

Polimeraza DNA zależna od RNA, umożliwia syntezę nici DNA, wykorzystując jako matrycę RNA. Enzym ten w naturze kodowany jest w otwartych ramkach odczytu retrowirusów. Proces, w którym bierze udział ten enzym, nosi nazwę odwrotnej transkrypcji.

Metoda CRISPR/Cas (ang. Clustered Regularly−Interspaced Short Palindromic Repeats, pol. zgrupowane, regularnie rozproszone, krótkie, powtarzające się sekwencje palindromiczne)

Metoda ta pozwala na edycję genomu organizmu, który posiada odpowiedni system naprawy uszkodzeń DNA (Eukaryota). Mechanizm immunologiczny, z którego wywodzi się ta metoda: u bakterii odpowiedni RNA umożliwia niszczenie genomu fagów dzięki enzymom Cas. Enzymy Cas rozcinają DNA bakteriofagów rozpoznany przez to RNA. Biotechnolodzy wprowadzają transgen kodujący sgRNA, przypominający funkcyjnie RNA z bakteryjnego CRISRP razem z transgenem kodującym Cas (najczęściej Cas9), do komórek eukariotycznych. W tych komórkach, w przeciwieństwie do komórek prokariotycznych, może dochodzić do naprawy uszkodzeń DNA, powodowanych przez Cas9 naprowadzony przez sgRNA na odpowiednie miejsce DNA. sgRNA jest kodowany oddzielnym transgenem regulowanym przez promotor taki jak np. U6 (przyłącza on odpowiednią polimerazę). Sekwencja CRISPR w naturze zawiera fragmenty genomów bakteriofagów, które bakteria wcześniej zwalczyła. Dlatego CRISPR to część systemu ochrony przed bakteriofagami. Na tym przykładzie widać, jak bardzo biotechnolodzy zmieniają pierwotne zastosowanie jakiegoś rozwiązania działającego w naturze.

PE prime editing − zastosowanie edycji prime

Metoda wywodzi się z CRISPR/Cas. Wykorzystuje się w niej jednak białko chimerowe mutanta Cas9 (H840A) połączone z domeną odwrotnej transkryptazy. Powstało pięć (a nawet siedem, uwzględniając NPE i TPE) kolejnych odmian tej metody. Metoda pozwala na uniknięcie niektórych błędów pojawiających się w czasie edycji genomu metodą CRIPSR/Cas tzw. INDELS niechciane insercje, delecje.

Sekwencje 2A (F2A, P2A)

Sekwencje kodujące peptydy 2A pochodzą z genomów wirusowych. Umieszczenie ich pomiędzy sekwencjami DNA (potem RNA) kodującymi dwa różne białka powoduje, że rybosom w czasie translacji po ukończeniu syntezy pierwszego białka niejako przeskakuje do syntezy następnego białka. W ten sposób biotechnolodzy mogą umieścić w wektorach sekwencje kodujące więcej niż jedno białko − transgen(y)/otwarte ramki odczytu, których ekspresja jest regulowana przez jeden promotor.

IRES

Skrót pochodzi od ang. internal ribosome entry site. To element RNA pozwalający inicjować translację w sposób niezależny od czapeczki mRNA 5’. IRES pozwala rybosomom zacząć syntezę w kilku miejscach jednego fragmentu (jednej molekuły) mRNA. W przeciwieństwie do P2A, IRES umożliwia startowe przyłączenie rybosomu w miejscu, gdzie występuje sekwencja charakteryzująca ten fragment RNA. Peptyd 2A ujawnia swój efekt, kiedy dojdzie do translacji białka zakończonego tą sekwencją peptydową. Wtedy ten rybosom, który ten fragment zsyntetyzował, podejmie syntezę kolejnego białka dzięki temu, że molekuła RNA, na której się znajduje, zawiera sekwencję kodującą kolejny peptyd.

Promotor SV-40, promotor CMV

Rozpoczęcie transkrypcji (proces syntezy RNA na matrycy DNA) u ssaków jest precyzyjnie regulowane. Wirusy DNA wykorzystują krótkie sekwencje, aby ten proces uruchomić. Do tych fragmentów DNA przyłączają się czynniki transkrypcyjne, do których przyłącza się polimeraza RNA. Popularne wśród biotechnologów ze względu na niewielki rozmiar są fragmenty (sekwencje) pochodzące z wirusów SV-40 i CMV.

CAR-T

Skrót określający limfocyty T, do których metodami inżynierii genetycznej wprowadzono transgen kodujący białka CAR, ang. chimeric antigen receptor). Białko to składa się z kilku domen, które bez ingerencji człowieka należą do kilku białek. W typowym CAR jest to domena scFv (ang. single-chain variable fragment) i domeny należącej do białek, które w limfocytach T transdukują (przekazują) sygnał umożliwiający zabijanie np. komórek zainfekowanych przez wirusa (CD28, 4-1 BB, CD3z itp). Typowy scFv to fragment zmienny łańcucha lekkiego i ciężkiego konkretnego przeciwciała połączony odpowiednim peptydem/linkerem. Takie działanie pozwala komórkom CAR-T eliminować komórki nowotworowe, które wykazują ekspresję genu kodującego białko rozpoznawane przez domenę scFv. Same przeciwciała nie wykazują takiej skuteczności jak CAR-T. Analogicznie skrót CAR-M będzie oznaczał makrofagi, do których wprowadzono transgen kodujący białko CAR.

Transgen, gen, otwarta ramka odczytu (ORF)

Określenie transgen zostało zarezerwowane w tym tekście dla sekwencji kodujących umieszczanych w odpowiednich wektorach przez człowieka. Natomiast gen tutaj to fragment genomu kodujący białko czy RNA, który powstał w naturze. Autor zdaje sobie sprawę że gen bakteryjny w plazmidzie (nie chromosomie bakteryjnym) nie różni się zasadniczo od transgenu bakteryjnego. Zdecydowano się jednak na rozróżnienie gen vs. transgen, ponieważ większość fragmentów kodujących umieszczanych w wektorach np. wirusowych, a opisanych w tym tekście, odnosi się do genomu człowieka. W przypadku Eukaryota ekspresja genu jest regulowana za pomocą promotora, wzmacniaczy, wyciszaczy, a pierwotny transkrypt ulega splicingowi. Transgen takiego genu ma natomiast sztuczny względem oryginalnego promotor (patrz promotor CMV/SV40), co zmienia sposób regulacji jego ekspresji. Gen u eukariotów położony jest w konkretnym miejscu genomu, transgen tego genu wprowadzony do genomu ludzkiego za pomocą np. wektorów wirusowych zazwyczaj ma położenie przypadkowe. Te różnice powodują np., że edycja genomu (konkretnego genu) w celach terapeutycznych jest rozwiązaniem bardziej pożądanym niż tradycyjna terapia genowa oparta o transgen. Różnic między genem a transgenem jest więcej. Termin otwarta ramka odczytu (ang. open reading frame ORF), został tu użyty w odniesieniu do genomów wirusowych i transgenów. W przypadku genomu wirusa jedna molekuła mRNA dostarcza kilku otwartych ramek odczytu − fragment kwasu nukleinowego wirusa, na bazie którego powstaje jedna cząsteczka mRNA koduje kilka białek. W tekście użyto tych trzech określeń dla fragmentów kwasów nukleinowych kodujących głównie białka. Gen czy transgen nie musi jednak kodować białka. Jak wskazano, sgRNA używane w metodzie CRISPR, czy PE (pegRNA), jest również kodowane przez transgen. W wektorach przygotowywanych przez biologów również pojawiają się odcinki DNA kodujące mRNA dla kilku białek właśnie dzięki wykorzystaniu rozwiązań pochodzących z genomów wirusowych.