Czy biotechnolodzy tworzą coś nowego, czy kradną naturze?

Jak powiedział Picasso: „Dobrzy artyści kopiują, wielcy kradną.” Podobnie wyrażali się między innymi: Igor Stravinsky, T.S. Eliot czy Steve Jobs.

Te słowa nie są jednak pochwałą kradzieży, ale zachętą do pokory i szacunku wobec tych, którzy tworzyli coś wcześniej. Zachętą do przyznania, że coś stworzone wcześniej było co najmniej inspiracją dla kolejnych pokoleń artystów. Przykładem jest las Birnam z Makbeta Szekspira, który inspirował Tolkiena przy opisie ataku Entów (pasterzy drzew) na Isengard.

Czy biotechnolodzy kradną (plagiatują) w takim sensie? Podobnie, jak artyści obserwują efekty pracy innych artystów, również biotechnolodzy obserwują pracę innych biotechnologów. Pojęcie „patentów” w sztuce (poza muzyką) bywa trudne do zdefiniowania – nie patentuje się obrazów. W biotechnologii jest o patenty trochę łatwiej. Mimo to urzędy patentowe ze zmienną konsekwencją przyznają lub nie prawa patentowe (własności intelektualnej) kolejnym projektantom. Jednak biotechnolodzy i artyści „plagiatują” jeszcze inaczej. „Plagiatują” naturę, a ta nie pójdzie oczywiście do sądu. Okazuje się jednak, że ma ona swoich rzeczników w urzędach patentowych w kwestiach biotechnologicznych. Przez wiele lat w urzędach patentowych trwał wielki spór o to, na ile rozwiązania podpatrzone w naturze mogą być patentowane. Rzecznicy patentowi wyznaczyli pewne kryteria, po spełnieniu których patent zostanie przyznany. Natomiast, biorąc pod uwagę cytat z Picassa, wobec kogo czy czego taki „złodziej biotechnolog” powinien taki rodzaj szacunku okazać?

Przeciwciała, enzymy do testów PCR, plazmidy, wektory wirusowe, nagrodzony Noblem CRISPR, promotory, sekwencje nukleotydowe czy aminokwasowe i wiele innych „rzeczy”, „ukradli” wirusom i bakteriom (na końcu tekstu znajduje się glosariusz wyjaśniający używane terminy biotechnologiczne). Po co…? Wcześniej chociażby po to, by produkować białka terapeutyczne i diagnostyczne. Ostatnio wszystko to, czego trochę nakradli, składają jak klocki lego w zupełnie nowe twory terapeutyczne, nazywając to już nie biotechnologią, a biologią syntetyczną.

Plazmidy służą bakteriom do tworzenia np. białek antybiotykooporności. Biotechnolodzy zamienili te fragmenty DNA w plazmidach w transgeny do produkcji białek potrzebnych ludziom – chociażby do produkcji insuliny dla chorych na cukrzycę. Nie dość, że ukradli bakteriom pomysł, to jeszcze go wykorzystują do produkcji np. leków.

Polimerazowa reakcja łańcuchowa (PCR), która stała się powszechnie znana w czasie pandemii COVID-19, to również w pewnym sensie zasługa bakterii. Jedne z nich, aby żyć w gorących źródłach Yellowstone „wymyśliły” białka, w tym polimerazę, które są w stanie przetrwać w wysokich temperaturach, a to dzięki niej możliwe jest szybkie prowadzenie PCR. W czasie tej reakcji temperatura wielokrotnie osiąga ponad 90 stopni Celsjusza, a większość molekuł polimerazy nie może ulec denaturacji. Oczywiście biotechnolodzy – za pomocą plazmidów z transgenem – zmuszają zwykłe bakterie (głównie E.coli) do produkcji tej polimerazy. Kradną polimerazę z jednych bakterii, a inne zmuszają do niewolniczej produkcji.

Skąd się wzięła odwrotna transkryptaza potrzebna, aby przepisać RNA (wirusa takiego jak SARS-CoV-2) na DNA przed reakcją PCR? Również ona została „skradziona”, tym razem wirusom.

Technologia CRISPR, nagrodzona nagrodą Nobla w 2020 roku, służąca obecnie np. do naprawy uszkodzonych genów, wywodzi się z systemu bakteryjnego, którym bakterie zwalczają swoich wrogów, wirusy bakteryjne – bakteriofagi. Pierwsza terapia oparta o CRISPR do leczenia osób z chorobą genetyczną – chorobą sierpowatokrwinkową – została zarejestrowana przez FDA w 2023 roku. System, z którego wywodzi się CRISPR/Cas chroni bakterie przed ich wirusami – to „element układu odpornościowego bakterii”. Bakterie tworzą „biblioteki” fragmentów genomów fagowych, aby wtedy, kiedy któryś znowu zaatakuje, zniszczyć go. Tworzenie bibliotek fragmentów genomów fagowych w genomie bakteryjnym jest więc przez niektórych autorów określane mianem budowania pamięci immunologicznej. Natomiast biotechnolodzy wykorzystują CRISPR/Cas do naprawy genomu np. w ludzkich komórkach. Widać więc, że podpatrywanie natury miało miejsce, ale zastosowanie rozwiązania Cas9 z zaprojektowanym fragmentem RNA jest już zupełnie inne. Powstają kolejne metody edycji genomu, takie jak prime editing, w których podkrada się naturze coraz więcej. Nie wolno robić edycji genomu na poziomie komórek linii germinalnych czy komórek zarodkowych człowieka, ale wolno na poziomie komórek somatycznych (dojrzałych i multipotentnych macierzystych).

Biotechnolodzy równocześnie próbują wykorzystać również naturalnego wroga bakterii, jakim są bakteriofagi, po to, żeby bakterie zwalczać. Jest to szczególnie ważne wobec pojawiającej się antybiotykoodporności. Rozwiązanie takie zaczyna być stosowane w produkcji żywności, ponieważ stosowanie antybiotyków chociażby w uprawach roślin czy hodowli drobiu to jedna z głównych przyczyn pojawiania się antybiotykoodporności.

Jak widać, bardzo wiele systemów wykorzystywanych przez biotechnologów powstało w trakcie walki organizmów z ich patogenami. Co nie powinno dziwić, bo taka walka jest akceleratorem ewolucji, a zatem tworzenia coraz doskonalszych rozwiązań.

Nie jest to jednak jedyne źródło, z którego pozyskuje się narzędzia czy technologie.

Biotechnolodzy wykorzystują bakterie (np. Agrobacterium tumefaciens), aby tworzyć rośliny GMO. Normalnie bakterie te infekują rośliny i wprowadzają swoje geny, żeby pozyskiwać od roślin opiny.

Wektory wirusowe stosowane np. w terapii genowej to wykorzystanie ułomnych czynników infekcyjnych, które w formie kompletnej infekują np. komórki ludzi, a u biotechnologów infekują komórki, aby wprowadzić do nich to, co chcą w nich umieścić. Jeśli chcemy zastosować wspomniany wcześniej CRISPR/Cas, to także najczęściej wykorzystujemy wirusy jako wektory tego systemu. Jeśli chce się wprowadzić „transgen leczniczy”, to również tak to się odbywa.

Bakterie, aby walczyć z bakteriofagami, „wymyśliły” – podobnie (jak CRISPR/Cas) – enzymy restrykcyjne. Biotechnolodzy korzystają z nich notorycznie, aby tworzyć wektory do produkcji np. białek leczniczych. Paradoksalnie system, który miał chronić bakterie przed ingerencją w ich DNA, służy do zmieniania ich DNA plazmidowego.

Bakteriofagi posiadają natomiast specjalne rekombinazy, umożliwiające wprowadzanie ich genów do genomu bakterii. Biotechnolodzy zastąpili tym systemem fagowym enzymy restrykcyjne, aby skonstruować/wygenerować system gate way – bramkowania − i szybciej przenosić między plazmidami np. transgeny lecznicze.

Biotechnolodzy w ogóle bardzo często korzystają z rozwiązań powstających w trakcie ewolucji wirusów. Genomy wirusów są bardzo małe, gdyż od upakowania na małej przestrzeni wielu informacji zależy ich przetrwanie. Biotechnolodzy również muszą upakowywać dużo informacji na małej przestrzeni, co wynika z niuansów technicznych ich pracy.

Wirusy „wymyśliły” więc np. sekwencję IRES, która pozwala otrzymywać z jednego fragmentu mRNA coś, co u eukariotów jest kodowane przez kilka genów. Wirusy geny zastąpiły czymś, co nazywa się otwartymi ramkami odczytu. Nie ma potrzeby, żeby kontrolować pojawianie się białek wirusowych w tak skomplikowany sposób, jak np. w komórkach człowieka. Zazwyczaj wszystkie białka wirusowe mogą, a nawet powinny pojawiać się równocześnie, aby doszło do samoskładania wirionów. W przypadku komórek człowieka tak nie jest. Istnieje wąska specjalizacja. To między innymi dzięki temu, pomimo że w każdej komórce jednego człowieka jest w zasadzie ten sam genom, mamy ponad 200 rodzajów komórek.

Podobnie jak IRES, peptydy (sekwencje) F2A czy P2A pozwalają wirusom na tworzenie wielu białek z jednej cząsteczki mRNA. Biotechnolodzy „plagiatują” te rozwiązania, aby również otrzymywać kilka białek z jednego fragmentu RNA. W tym przypadku rybosom po zakończeniu translacji jednego białka przeskakuje niejako do translacji następnego. IRES pozwala przyłączać się rybosomom w kilku miejscach mRNA i inicjować translację.

Wirusy regulują transkrypcję (przepisywanie DNA na RNA) za pomocą bardzo małych fragmentów regulacyjnych i w ten sposób wymuszają produkcję swojego RNA w komórkach ssaków. Te małe elementy regulacyjne z wirusów SV-40 czy CMV również zostały wykorzystane przez biotechnologów.

Oczywiście nie wyczerpuje to wszystkich elementów, które są plagiatowane z organizmów żywych przez biotechnologów.

Ponadto nie wszystkie rozwiązania pochodzą ze świata patogenów.

Przeciwciała wykorzystywane np. w diagnostyce normalnie służą do zwalczania patogenów. Biotechnolodzy wytwarzają je do: testów onkologicznych, wirusowych (kupujemy je w aptece), a nawet do testów ciążowych. To rozwiązanie układu odpornościowego różnych zwierząt. Ostatnio plagiatują je np. od alpak, ale również od rekinów, gdyż te mają dość sprytne (bardzo małe) przeciwciała.

Szczepionki to również zaprzęgnięcie do działań człowieka naturalnego systemu odpornościowego. Do ich tworzenia wykorzystywane są plazmidy, wektory wirusowe itp., opisane wcześniej. W naturze cena nabywania odporności jest bardzo wysoka. Często jest to kalectwo, niekiedy śmierć członków społeczności.

Przeciwnowotworowa terapia CAR-T jest wspólnym dziełem natury, biotechnologów i immunologów. Polega na połączeniu odpowiedzi limfocytów T i limfocytów B. Skradziono więc układowi odpornościowemu dwa rozwiązania i stworzono ich funkcyjną chimerę przy okazji tworzenia chimerowego białka. Powstała komórka, która nie wymaga prezentowania antygenu na cząsteczkach HLA (MHC), ale rozpoznająca go bezpośrednio. Pozwala to uniknąć niektórych działań, komórek nowotworowych, których one dokonują, aby „zmylić” układ odpornościowy. Litera C w nazwie CAR-T pochodzi właśnie od chimerowy (ang. chimeric).

CAR-T to przykład nowego świata biotechnologii, czyli biologii syntetycznej. W tym świecie biotechnolodzy tworzą nowe byty np. komórkowe, ale również kradną istniejące w przyrodzie elementy regulatorowe, białka itp. Również białka używane do edycji (naprawiania) genów w ramach metod nowocześniejszych niż CRISPR, takich jak prime editing, to białka chimerowe. Podbieranie elementów ze świata przyrody to pierwszy etap. Kolejny − to tworzenie z nich nowych, nieistniejących w przyrodzie bytów, takich jak komórki. Układy te są na tyle skomplikowane, że zaczyna się je porównywać do układów scalonych. Jest to dość luźna analogia, ponieważ komórka ma inną organizację przestrzenną niż układ scalony, ale obrazuje złożoność zmian, które biologia syntetyczna oferuje.

Na czym więc bardzo często polega biotechnologia czy biologia syntetyczna? Polega na podpatrywaniu natury i wykorzystywaniu jej wynalazków w innych celach niż te, dla których natura je wytworzyła. Sposoby korzystania z tych wytworów stają się coraz bardziej wyrafinowane. Najczęściej korzysta się z tego, co powstało w ramach ewolucyjnego wyścigu zbrojeń między bakteriofagami, a bakteriami, czy między naszym układem odpornościowym, a patogenami.

Glosariusz z wyjaśnieniami ( w celach popularyzacji)

PCR − łańcuchowa reakcja polimerazy, PCR (od ang. polymerase chain reaction)

Metoda powielania dwuniciowych fragmentów DNA. W trakcie reakcji odbywa się od 25 do 40 cykli, w czasie których dochodzi do kopiowania wybranego fragmentu DNA temperatura zmienia się od 45 do 95 stopni Celsjusza.

Odwrotna transkryptaza

Polimeraza DNA zależna od RNA, umożliwia syntezę nici DNA, wykorzystując jako matrycę RNA. Enzym ten w naturze kodowany jest w otwartych ramkach odczytu retrowirusów. Proces, w którym bierze udział ten enzym, nosi nazwę odwrotnej transkrypcji.

Metoda CRISPR/Cas (ang. Clustered Regularly−Interspaced Short Palindromic Repeats, pol. zgrupowane, regularnie rozproszone, krótkie, powtarzające się sekwencje palindromiczne)

Metoda ta pozwala na edycję genomu organizmu, który posiada odpowiedni system naprawy uszkodzeń DNA (Eukaryota). Mechanizm immunologiczny, z którego wywodzi się ta metoda: u bakterii odpowiedni RNA umożliwia niszczenie genomu fagów dzięki enzymom Cas. Enzymy Cas rozcinają DNA bakteriofagów rozpoznany przez to RNA. Biotechnolodzy wprowadzają transgen kodujący sgRNA, przypominający funkcyjnie RNA z bakteryjnego CRISRP razem z transgenem kodującym Cas (najczęściej Cas9), do komórek eukariotycznych. W tych komórkach, w przeciwieństwie do komórek prokariotycznych, może dochodzić do naprawy uszkodzeń DNA, powodowanych przez Cas9 naprowadzony przez sgRNA na odpowiednie miejsce DNA. sgRNA jest kodowany oddzielnym transgenem regulowanym przez promotor taki jak np. U6 (przyłącza on odpowiednią polimerazę). Sekwencja CRISPR w naturze zawiera fragmenty genomów bakteriofagów, które bakteria wcześniej zwalczyła. Dlatego CRISPR to część systemu ochrony przed bakteriofagami. Na tym przykładzie widać, jak bardzo biotechnolodzy zmieniają pierwotne zastosowanie jakiegoś rozwiązania działającego w naturze.

PE prime editing − zastosowanie edycji prime

Metoda wywodzi się z CRISPR/Cas. Wykorzystuje się w niej jednak białko chimerowe mutanta Cas9 (H840A) połączone z domeną odwrotnej transkryptazy. Powstało pięć (a nawet siedem, uwzględniając NPE i TPE) kolejnych odmian tej metody. Metoda pozwala na uniknięcie niektórych błędów pojawiających się w czasie edycji genomu metodą CRIPSR/Cas tzw. INDELS niechciane insercje, delecje.

Sekwencje 2A (F2A, P2A)

Sekwencje kodujące peptydy 2A pochodzą z genomów wirusowych. Umieszczenie ich pomiędzy sekwencjami DNA (potem RNA) kodującymi dwa różne białka powoduje, że rybosom w czasie translacji po ukończeniu syntezy pierwszego białka niejako przeskakuje do syntezy następnego białka. W ten sposób biotechnolodzy mogą umieścić w wektorach sekwencje kodujące więcej niż jedno białko − transgen(y)/otwarte ramki odczytu, których ekspresja jest regulowana przez jeden promotor.

IRES

Skrót pochodzi od ang. internal ribosome entry site. To element RNA pozwalający inicjować translację w sposób niezależny od czapeczki mRNA 5’. IRES pozwala rybosomom zacząć syntezę w kilku miejscach jednego fragmentu (jednej molekuły) mRNA. W przeciwieństwie do P2A, IRES umożliwia startowe przyłączenie rybosomu w miejscu, gdzie występuje sekwencja charakteryzująca ten fragment RNA. Peptyd 2A ujawnia swój efekt, kiedy dojdzie do translacji białka zakończonego tą sekwencją peptydową. Wtedy ten rybosom, który ten fragment zsyntetyzował, podejmie syntezę kolejnego białka dzięki temu, że molekuła RNA, na której się znajduje, zawiera sekwencję kodującą kolejny peptyd.

Promotor SV-40, promotor CMV

Rozpoczęcie transkrypcji (proces syntezy RNA na matrycy DNA) u ssaków jest precyzyjnie regulowane. Wirusy DNA wykorzystują krótkie sekwencje, aby ten proces uruchomić. Do tych fragmentów DNA przyłączają się czynniki transkrypcyjne, do których przyłącza się polimeraza RNA. Popularne wśród biotechnologów ze względu na niewielki rozmiar są fragmenty (sekwencje) pochodzące z wirusów SV-40 i CMV.

CAR-T

Skrót określający limfocyty T, do których metodami inżynierii genetycznej wprowadzono transgen kodujący białka CAR, ang. chimeric antigen receptor). Białko to składa się z kilku domen, które bez ingerencji człowieka należą do kilku białek. W typowym CAR jest to domena scFv (ang. single-chain variable fragment) i domeny należącej do białek, które w limfocytach T transdukują (przekazują) sygnał umożliwiający zabijanie np. komórek zainfekowanych przez wirusa (CD28, 4-1 BB, CD3z itp). Typowy scFv to fragment zmienny łańcucha lekkiego i ciężkiego konkretnego przeciwciała połączony odpowiednim peptydem/linkerem. Takie działanie pozwala komórkom CAR-T eliminować komórki nowotworowe, które wykazują ekspresję genu kodującego białko rozpoznawane przez domenę scFv. Same przeciwciała nie wykazują takiej skuteczności jak CAR-T. Analogicznie skrót CAR-M będzie oznaczał makrofagi, do których wprowadzono transgen kodujący białko CAR.

Transgen, gen, otwarta ramka odczytu (ORF)

Określenie transgen zostało zarezerwowane w tym tekście dla sekwencji kodujących umieszczanych w odpowiednich wektorach przez człowieka. Natomiast gen tutaj to fragment genomu kodujący białko czy RNA, który powstał w naturze. Autor zdaje sobie sprawę że gen bakteryjny w plazmidzie (nie chromosomie bakteryjnym) nie różni się zasadniczo od transgenu bakteryjnego. Zdecydowano się jednak na rozróżnienie gen vs. transgen, ponieważ większość fragmentów kodujących umieszczanych w wektorach np. wirusowych, a opisanych w tym tekście, odnosi się do genomu człowieka. W przypadku Eukaryota ekspresja genu jest regulowana za pomocą promotora, wzmacniaczy, wyciszaczy, a pierwotny transkrypt ulega splicingowi. Transgen takiego genu ma natomiast sztuczny względem oryginalnego promotor (patrz promotor CMV/SV40), co zmienia sposób regulacji jego ekspresji. Gen u eukariotów położony jest w konkretnym miejscu genomu, transgen tego genu wprowadzony do genomu ludzkiego za pomocą np. wektorów wirusowych zazwyczaj ma położenie przypadkowe. Te różnice powodują np., że edycja genomu (konkretnego genu) w celach terapeutycznych jest rozwiązaniem bardziej pożądanym niż tradycyjna terapia genowa oparta o transgen. Różnic między genem a transgenem jest więcej. Termin otwarta ramka odczytu (ang. open reading frame ORF), został tu użyty w odniesieniu do genomów wirusowych i transgenów. W przypadku genomu wirusa jedna molekuła mRNA dostarcza kilku otwartych ramek odczytu − fragment kwasu nukleinowego wirusa, na bazie którego powstaje jedna cząsteczka mRNA koduje kilka białek. W tekście użyto tych trzech określeń dla fragmentów kwasów nukleinowych kodujących głównie białka. Gen czy transgen nie musi jednak kodować białka. Jak wskazano, sgRNA używane w metodzie CRISPR, czy PE (pegRNA), jest również kodowane przez transgen. W wektorach przygotowywanych przez biologów również pojawiają się odcinki DNA kodujące mRNA dla kilku białek właśnie dzięki wykorzystaniu rozwiązań pochodzących z genomów wirusowych.

Dlaczego nie mamy ogona?

Wszyscy wiemy, że ludzie nie mają ogonów. Nie jest to do końca prawdą: w czasie życia płodowego mamy ogon, który zanika mniej więcej w ósmym tygodniu. Jego pozostałość to kość guziczna (ogonowa), która jest połączeniem zrośniętych kręgów ogona (zazwyczaj czterech). Nie ma ogona też u naszych najbliższych krewnych: szympansów, goryli, orangutanów i gibonów. Dlaczego u tych gatunków ogony zniknęły? Niedawno ukazała się publikacja, w której wyjaśniono jak to się stało.

Gen brachyury czyli TBXT

Pierwszą badaczką, która zwróciła uwagę na możliwość zaniknięcia ogona u zwierząt, które go mają, była urodzona w Kijowie Nadia Dobrowolska-Zawadska (1878-1954, Ryc. 1). Studiowała medycynę w Sankt Petersburgu, a w czasie I wojny światowej była lekarką w armii carskiej (później w armii Piotra Wrangla). Od 1921 r. pracowała w Instytucie Pasteura w Paryżu. Badała tam wpływ naświetlania promieniami Roentgena na układ kostny myszy, i w 1927 r. udało jej się otrzymać szczep myszy pozbawionych ogona. Podejrzewała, że myszy te mają mutacje w genie odpowiedzialnym za kształtowanie się ogona w czasie życia płodowego. Obecność dwóch kopii takiego genu była śmiertelna, ale jedna kopia powodowała, że ogona nie było. Nazwała tę cechę brachyury (z greckiego: krótki ogon).

Ryc. 1. Nadia Dobrowolska-Zawadska.  Źródło: Wikipedia, domena publiczna.

Sekwencja genu odpowiedzialnego za brak ogona została poznana w 1990 r. Wykazano wtedy, że koduje on czynnik transkrypcyjny, czyli białko, które wiążąc się do określonej sekwencji DNA w genie reguluje transkrypcję tego genu (czyli przepisanie na mRNA). Nazywany początkowo genem T (od tail, czyli ogon), obecnie nosi nazwę TBXT i wchodzi w skład rodziny genów T. U człowieka jest 15 genów należących do tej rodziny. Większość z nich koduje białka regulujące kształtowanie się narządów w czasie rozwoju płodowego.

Homologi (czyli odpowiedniki) genu TBXT występują u wszystkich zwierząt dwubocznie symetrycznych, gdzie wpływają na transkrypcję genów regulujących powstawanie mezodermy, która jest jednym z trzech podstawowych listków zarodkowych, czyli zespołów komórek powstających w czasie rozwoju zarodkowego.

Sekwencje Alu w genie TBXT, czyli co stało się u przodków człekokształtnych?

Autorzy publikacji znaleźli w ludzkim genie TBXT dwie sekwencje Alu. Nie było to nic nadzwyczajnego. Sekwencje Alu (nazywane tak od enzymu restrykcyjnego, które je rozpoznaje) to krótkie fragment DNA (długość ok. 300 par zasad), które mogą wbudowywać się w dowolnych miejscach naszego DNA. Sekwencje takie jak Alu nazywane sią transpozonami albo skaczącymi genami. W ludzkim genomie jest ok. miliona sekwencji Alu. Jeżeli jest ich tak dużo, to dlaczego odegrały tak dużą rolę akurat w genie TBXT?

Tu krótkie wyjaśnienie: większość eukariotycznych genów składa się z sekwencji kodujących białka nazywanych eksonami, i sekwencji, które nie kodują białek (są to introny). Po transkrypcji introny zostają usunięte w ramach procesu nazywanego splajsingiem. Zdarza się niekiedy, że w czasie tego procesu niektóre eksony mogą być pominięte: takie zjawisko nazywamy alternatywnym splajsingiem. Skutkiem jest powstanie różnych białek: takich, które zawierają sekwencje kodowane przez dany ekson (lub eksony), i takich, które tych sekwencji nie zawierają.

W ludzkim genie TBXT (a także w jego odpowiedniku u szympansa, goryla, orangutana i gibona) obecne są dwie sekwencje Alu: jedną, o nazwie AluS, znaleziono także u pozostałych małp. Druga, o nazwie AluY, jest jedynie u wymienionych wyżej małp bez ogona. Obie te sekwencje znajdują się w intronach po dwóch stronach eksonu 6. Ich obecność powoduje, że w czasie splajsingu kompleks zwany splajsosomem może wyciąć ekson 6 wraz z okalającymi go intronami, lub też może go nie wyciąć. Powstają w ten sposób dwie formy białka TBXT: jedna zawiera sekwencję kodowaną przez ekson 6, a druga nie. Jest to właśnie alternatywny splajsing (Ryc. 2).

Ryc. 2. Schemat alternatywnego splajsingu w genie TBXT u człowieka. Eksony w kolorze niebieskim, sekwencje Alu w czerwonym. Gen TBXT składa się z 8 eksonów, pokazano tylko eksony 4-7. Według: Konkel MK et al., Nature 2024, 626: 958, zmodyfikowane.

Czy obie formy są potrzebne? Wydaje się, że tak. Autorzy publikacji wykazali, że u myszy z usuniętym eksonem 6 (czyli u takich, u których wszystkie białka TBXT nie zawierają sekwencji kodowanej przez ekson 6) powstają wady rozwojowe cewy nerwowej. Są to wrodzone wady ośrodkowego układu nerwowego; zalicza się do nich m.in. bezmózgowie, rozszczep kręgosłupa, przepuklinę mózgową i oponową. U człowieka takie zaburzenia występują z częstością 1: 1000 urodzeń.

Zwierzęta bez ogona

Małpy nie są jedynymi zwierzętami pozbawionymi ogonów. Na wyspie Man znajdującej się na Morzu Irlandzkim istnieje rasa kotów pozbawionych ogonów, nazywana Manx (Ryc. 3).

Ryc. 3. Kot z wyspy Man. Źródło: Wikipedia, Michelle Weigold. Licencja CC BY-SA 4.0.

Również psy niektórych ras, jak np. Welsh Pembroke Corgi nie mają ogonów (Ryc. 4).

Ryc. 4. Welsh Pembroke Corgi. Źródło: Wikipedia, Marsiyanka. Licencja CC BY-SA 3.0.

Przeważnie (chociaż nie zawsze) przyczyną takiego braku są mutacje w genie TBXT. Nie jest to jednak związane z obecnością dodatkowych kopii sekwencji Alu, ale z punktowymi mutacjami pojedynczych nukleotydów. Mutacje te powodują, że białko kodowane przez taki gen nie aktywuje właściwych genów w czasie życia płodowego. Cecha braku ogona jest dziedziczona recesywnie; to znaczy, że potrzeba dwóch kopii genu TBXT z mutacjami, żeby ogona nie było.

Dlaczego przodkowie ludzi i małp człekokształtnych stracili ogony?

Utrata ogona miała miejsce ok. 25 milionów lat temu, kiedy przodkowie człekokształtnych oddzielili się od przodków dzisiejszych małp ogoniastych (Ryc. 5).

Ryc. 5. Ewolucja braku ogona u naczelnych. Według: Xia B. et al., The genetic basis of tail-loss evolution in humans and apes, BioRXiv https://doi.org/10.1101/2021.09.14.460388. Licencja CC BY-SA 4.0.

Nie bardzo wiadomo, dlaczego ogon zaniknął. Istnieje hipoteza, że brak ogona umożliwiał lepsze poruszanie się na dwóch tylnych kończynach, a także przenoszenie większych przedmiotów w kończynach przednich. Być może tak było, ale należy pamiętać, że niewielki zysk w postaci lepszego poruszania się na dwóch nogach jest okupiony kosztem w postaci dość wysokiej częstości wad cewy nerwowej. Ponadto, obserwacje małp z podrodziny kapucynek (np. kapucynka brodata, Sapojus libidinosus) sugerują, że małpy te używają ogona do podpierania się (Ryc. 6). Również roboty wyposażone w coś w rodzaju ogona są bardziej stabilne i mogą nosić większe ciężary. Może więc ogon nie jest jednak wcale taki zły i przydałby się nam i dziś?

Ryc. 6. Kapucynka brodata używająca kamienia do rozbijania orzechów i podpierająca się ogonem. Autor: Allan Hopkins (https://www.flickr.com/photos/hoppy1951/). Licencja CC BY-NC-ND 2.0.

Bardziej prawdopodobna jest inna hipoteza. Ok. 25 milionów lat temu we wschodniej Afryce miało miejsce oddzielenie się płyty afrykańskiej od płyt arabskiej i somalijskiej. Powstały wtedy Wielkie Rowy Afrykańskie, a skutkiem były zmiany klimatyczne. Te z kolei powodowały zmianę puszcz w sawanny i izolację niewielkich liczebnie grup zwierząt. Przypadkowa mutacja, niemająca wpływu na przystosowanie do środowiska, mogła w takiej izolowanej populacji rozpowszechnić się w ramach tzw. dryfu genetycznego. Zmiana ta musiała zajść u wspólnego przodka człekokształtnych, bo wszystkie gatunki potomne mają w genie TXBT tak samo ułożone sekwencje Alu. Jeśli to prawda, to można powiedzieć że ogon straciliśmy niejako przypadkiem. A utrata ogona jest jeszcze jednym przykładem sytuacji, w której dryf genetyczny przeważa nad doborem.

Literatura dodatkowa

Ruchomy element DNA i brak ogona u ludzi

https://www.nature.com/articles/d41586-024-00309-z

Charakterystyka genetyczna krótkoogoniastych zwierząt

http://acdrutkowscy.pl/files/ciekawostka-11.pdf

Jak zostać królową, czyli do czego służy obżarstwo (u pszczół)

(ku pokrzepieniu serc wszystkich, którzy uważają, że przesadzili z pączkami w Tłusty Czwartek)

Swoje dwa pierwsze wpisy poświęciłam na wyjaśnienie mechanizmu odpowiedzialnego za to, czy pszczoła (Apis mellifera) staje się samicą albo samcem: działa on na zasadzie molekularnego przełącznika, którym jest gen csd – jeżeli pszczoły posiadają dwie różne odmiany (allele) genu csd – stają się samicami, jeżeli posiadają tylko jedną kopię csd (lub dwie kopie, ale tej samej odmiany) – stają się samcami. Choć mechanizm determinacji płci na poziomie molekularnym składa się z wielu następujących po sobie procesów, to jednak na jego początku znajdują się białka csd, których działanie skierowuje rozwijającą się pszczołę na jedną z dwóch ścieżek. Przypadki pośrednie, to znaczy pszczoły z nieokreśloną płcią, są praktycznie nieznane. Determinacja płci u pszczół działa więc zero-jedynkowo, a ponadto jest ściśle uzależniona od czynników genetycznych.

Kasty u pszczół

Równie fascynujące, ale dużo bardziej skomplikowane są mechanizmy, które są odpowiedzialne za to, do jakiej kasty należeć będzie samica – czy stanie się matką (królową), czy też robotnicą. Kastowość jest zjawiskiem stosunkowo popularnym u owadów społecznych – polega ono na tym, że z osobników identycznych genetycznie mogą się rozwinąć osobniki, które będą znacząco się różnić, tworząc wyodrębnione grupy (kasty) spełniające w rodzinie odrębne funkcje. O ile więc niewłaściwe jest uważanie trutni za odrębną kastę (bo różnią się one genetycznie od samic), o tyle robotnice i królowe należą faktycznie do osobnych kast. Różnice pomiędzy królowymi i robotnicami widać już na pierwszy rzut oka. Robotnice są znacznie mniejsze (ok. 1,5x), co szczególnie jest widoczne w przypadku odwłoka, który u robotnic jest zakryty skrzydełkami, natomiast u matek skrzydełka sięgają jedynie do mniej więcej połowy jego długości.

Robotnica (u góry) i matka (na dole). Fot. Alex Wild

Odwłok królowej skrywa w swoim wnętrzu cały układ rozrodczy, a najwięcej miejsca zajmują ogromne jajniki (zbudowane ze średnio 160 rurek jajnikowych), zdolne do produkowania nawet kilku tysięcy komórek jajowych dziennie. Jajniki robotnic są bardzo silnie zredukowane i zawierają zaledwie kilka rurek jajnikowych. Robotnice nie posiadają też rozwiniętej spermateki, czyli narządu, w którym gromadzone są plemniki trutni przekazywane matce w czasie lotu godowego, oraz gruczołów wydzielających substancje utrzymujące plemniki przy życiu.

Jajniki królowej (po lewej) i robotnic (po prawej). Duncan i wsp., 2016

Królowe z kolei nie posiadają cech, które są potrzebne robotnicom do spełniania roli jako karmicielek, zbieraczek i obrończyń. Robotnice posiadają więc dłuższe języczki, którymi pobierają nektar, mają lepiej rozwinięte oczy i więcej receptorów na swoich czułkach. Posiadają koszyczki na zewnętrznej powierzchni goleni tylnej pary odnóży, służące do przenoszenia pyłku. Robotnice mają także gruczoły wydzielające wosk, który służy do budowy plastra. Matki i robotnice różnią się jakością wydzielanych przez siebie feromonów i obecnością gruczołów ich produkujących.

Bardzo ciekawą różnicą pomiędzy matkami a robotnicami jest budowa żądła – robotnice posiadają żądła przypominające harpun, co powoduje, że żądło pozostaje w skórze atakowanego zwierzęcia i stanowi skuteczny środek obrony przez drapieżnikami (kto został choć raz pożądlony przez pszczoły, ten wie, jak bardzo skuteczny), niestety jednak powodujący, że robotnice giną w czasie obrony swojej rodziny. Do zadań matek nie należy obrona gniazda, co jednak nie znaczy, że są pacyfistkami – żądło służy im do pojedynkowania się z innymi matkami w obrębie tej samej rodziny i do zabijania jeszcze niewyklutych matek. Ten proces siostrobójstwa następuje wtedy, gdy rodzina wychowuje nową matkę, która ma zastąpić starą i niesprawną matkę lub objąć panowanie w rodzinie, z której stara matka odleciała (w czasie rojenia się). Jako gwarancję, że wszystko pójdzie jak należy, pszczoły wychowują więcej młodych matek, które później brutalnie rozstrzygają między sobą, która „obejmie panowanie” w rodzinie. Zrozumiałe jest zatem, że żądła matek nie mogą pozostawać w ciele ich ofiar, bo wtedy one same stały by się ofiarą swojego zwycięstwa – ich żądła nie posiadają zatem zadziorków, a zdolność do produkcji jadu spada wraz z wiekiem matki, bo po młodzieńczym okresie pojedynkowania się jad przestaje być królowej potrzebny. Również skład jadu różni się pomiędzy robotnicami a matką – ten u robotnic jest bardziej przystosowany do zrobienia jak największej szkody kręgowcom, zaś matki – innym pszczołom.

Walka matek (http://beespoke.info/2016/06/25/fighting-queen-bees)

Co jedzą królowe i robotnice

Przywiązałam tak nieproporcjonalnie dużą wagę do żądła i jadu nie bez powodu; po pierwsze, ten przykład obrazuje wiele poziomów, na których różnią się matki i robotnice (zachowanie, anatomia i skład wydzielanych substancji), co z kolei silnie sugeruje, jak złożone muszą być procesy, które są w stanie sterować rozwojem tak różnych od siebie pszczół z identycznych genetycznie osobników. Po drugie zaś – pojedynkowanie się młodych matek kieruje naszą uwagę na wspomniany już proces ich powstawania. A to właśnie różnice w sposobach wychowywania larw przez rodzinę decydują o tym, czy pszczoła będzie królową lub robotnicą.

Ze złożonego przez królową zapłodnionego jaja po trzech dniach wykluwa się larwa, która przez pierwsze trzy dni swojego życia karmiona jest mleczkiem pszczelim wydzielanym przez pszczoły-karmicielki. Po tym czasie larwy przeznaczone do bycia matkami są w dalszym ciągu karmione tym „królewskim” mleczkiem (RJ, od angielskiego „royal jelly”), natomiast larwy przyszłych robotnic karmione mleczkiem „robotnic” (WJ, ang. „worker jelly”) z dodatkiem miodu i pyłku roślin. O ile przyszłe królowe są karmione bardzo obficie i wręcz pływają w przeznaczonym dla nich pokarmie, to robotnice są karmione tylko wystarczająco.

Po lewej: larwy przyszłych królowych skąpane w mleczku pszczelim (https://www.wired.com/2015/09/royal-jelly-isnt-makes-queen-bee-queen-bee/; Waugsberg CC). Po prawej: poczwarka królowej wewnątrz swojej komórki, Ryszard Maleszka BY CC)

Jeśli to właśnie pokarm jest tym, co różnicuje kasty, to oczywistym staje się pytanie, czym różnią się od siebie pokarmy robotnic i królowych. Najbardziej zauważalną różnicą jest znacznie większa ilość cukrów w RJ – dowiedziono eksperymentalnie, że suplementacja pokarmu robotnic zwiększoną ilością cukru sprawia, że zaczynają rozwijać się matki. Czyżby to było aż takie proste? Chyba nie. Badacze skłaniają się ku hipotezie, że zwiększona podaż cukru zachęca larwy do jedzenia, innymi słowy: cukier działałby jako stymulant apetytu dla niejadków, powodując, że larwy przy okazji jadłyby większą ilość innych substancji zawartych w podawanym im pokarmie, a które miałyby sprawić, że rozwijałyby się królowe. Czym są te tajemnicze inne substancje? Nie do końca wiadomo – kilka lat temu zostało ogłoszone, że jest to jedno z białek zawartych w dużych ilościach w RJ – białko MRJP1 (ang. major royal jelly protein 1, „royalactin”), ale autorzy kolejnej pracy stwierdzili, że to nieprawda i że nie da się powtórzyć eksperymentów wskazujących na decydującą rolę MRJP1. W odpowiedzi autor pierwszej pracy udowadniał, że autorzy drugiej pracy użyli innych warunków hodowli pszczół… Spór trwa.

Robotnice rozwijają się w małych (drugi plan), zaś matki w dużych, zwisających komórkach. Fot. Rusty Barlow (https://www.honeybeesuite.com/is-it-a-swarm-cell-or-a-supersedure-cell)

Jacy są inni kandydaci? Jest nim na przykład 10-HDA (kwas 10-hydroksy-2-decenowy), którego jest znacznie więcej w RJ. 10-HDA jest substancją hamującą enzym zwany deacetylazą histonów. Acetylacja histonów, białek wokół których oplecione są nici DNA, powoduje, że DNA jest bardziej „rozluźnione”, co wpływa pozytywnie na możliwość ekspresji genów. Deacetylaza, odrywając reszty acetylowe od histonów, powoduje, że DNA jest ciaśniej nawinięte i niedostępne. 10-HDA zatem, hamując deacetylazę, powoduje zwiększoną dostępność DNA i podwyższa poziom ekspresji genów.

Inni badacze zwrócili zaś uwagę, że może za bardzo zafiksowaliśmy się na poszukiwaniu składników pokarmu charakterystycznych dla pokarmu matek, a nie zwracamy wystarczająco dużo uwagi na elementy pokarmu robotnic. Takim składnikiem mogłyby być tzw. mikroRNA, czyli krótkie RNA pełniące funkcje regulujące (na ogół negatywnie) ekspresję genów. Okazało się, że w pokarmie robotnic jest zdecydowanie więcej mikroRNA i że sztuczna suplementacja pokarmu królowej tymi mikro-RNA powoduje zwrot rozwoju w kierunku robotnic. Innym ciekawym odkryciem było pokazanie, że jeden ze składników pyłku kwiatowego, który dodawany jest wyłącznie do pokarmu robotnic, a którym jest kwas p-kumarowy, działa jako środek chemicznej kastracji. Dodanie kwasu p-kumarowego do pokarmu matek powodowało niedorozwój jajników.

Jeden, by wszystkimi rządzić?

Jest bardzo prawdopodobne (a w zasadzie już pewne), że poszukiwanie pojedynczego czynnika różnicującego pokarm matek i robotnic jest skazane na niepowodzenie. Jest to stwierdzenie dość uzasadnione – zakłada bowiem, że gdyby pojedynczy czynnik zarządzał wszystkim, to determinacja kasty byłaby zero-jedynkowa, czyli np. gdyby ten czynnik był obecny, to larwa rozwijałaby się jako królowa, a jeśli nie – jako robotnica, analogicznie do sytuacji przy determinacji płci (dwa różne allele csd – samica, brak różnych – samiec). Tymczasem w determinacji kast takiej zero-jedynkowej sytuacji nie obserwujemy, szczególnie w warunkach laboratoryjnej hodowli larw. Istnieją bowiem osobniki form pośrednich, to znaczy robotnice z pewnymi cechami matek, albo matki z cechami robotnic. Granica pomiędzy tymi pośrednimi formami jest płynna. Istnienie form pośrednich wskazuje na to, że sygnały pochodzące ze środowiska są złożone i równie złożone są szlaki sygnałowe od nich zależne, zaś odpowiednia siła tych sygnałów prowadzi do zróżnicowanej ekspresji genów odpowiedzialnej za różne ścieżki rozwojowe. Sprawia to, że o odtworzenie idealnych warunków jest praktycznie niemożliwe w warunkach laboratoryjnych. Formy pośrednie pomiędzy matkami i robotnicami pojawiają się również naturalnie – dzieje się tak wtedy, gdy larwa nieco starsza niż trzydniowa zaczyna być na nowo karmiona pokarmem matek. Taka sytuacja ma miejsce np. wtedy, gdy z powodu jakiejś katastrofy ginie panująca w rodzinie królowa (np. nie wraca z lotu godowego), a w gnieździe brakuje młodszych larw. Powstaje więc awaryjna matka, znacznie mniejsza niż te „prawdziwe”, która nie posiada również pełnego potencjału rozrodczego. Jej zadaniem jest przeprowadzenie rodziny przez kryzys – składa zatem zapłodnione jaja, z których robotnice wychowują pełnowartościowe matki. Po spełnieniu tej funkcji awaryjna matka zostaje zlikwidowana (muszę przyznać, że wchodząc w szczegóły życia rodzinnego pszczół przestaję być ich bezkrytyczną fanką).

Wchodząc głębiej

Wiedząc, że to składniki pokarmu pełnią kluczową rolę w decyzji o wyborze kasty, ale nie wiedząc, które konkretnie czynniki to są, można teraz (z pewnym zakłopotaniem) spróbować wejść głębiej w molekularne mechanizmy tych procesów, czyli spróbować zdefiniować, które szlaki sygnałowe są regulowane przez te enigmatyczne czynniki zewnętrzne. To, co już wiadomo na pewno, to fakt, że do tych szlaków sygnałowych należą IIS (ang. insulin and insulin-like signalling) i TOR (ang. target of rapamycin) – zaburzenie tych szlaków sygnałowych (obu lub z osobna) poprzez obniżenie (za pomocą techniki RNAi) poziomu ekspresji genów kodujących ich elementy, prowadziło do zahamowania powstawania matek i skierowanie rozwoju w stronę robotnic. Szlaki te ze sobą współdziałają prowadząc do powstawania hormonu juwenilnego – podawanie hormonu juwenilnego larwom z uszkodzonymi szlakami IIS i TOR przywracało rozwój matek. Funkcją hormonu juwenilnego jest zaś zapobieganie programowanej śmierci (apoptozy) komórek tworzących jajniki. Hormon juwenilny kontroluje również uwalnianie eksdysteroidów, które biorą udział zarówno w rozwoju jajników, ale na dalszym etapie rozwoju – również mózgu.

Chciałabym jeszcze raz podkreślić, że osobniki poszczególnych kast mogą się rozwinąć z osobników identycznych genetycznie. O ile więc podłoże genetyczne jest takie samo, omawiane procesy muszą wpływać na bardzo zróżnicowaną ekspresję genów – to jest włączanie lub wyłączanie aktywności poszczególnych genów. Informacja o tym, który gen ma być włączony lub wyłączony musi być dziedziczona przez kolejne pokolenia komórek rozwijającej się pszczoły. Taką kontrolę ekspresji genów nazywa się kontrolą epigenetyczną, a podstawowymi mechanizmami za nią stojącymi są wspomniana już modyfikacja histonów i metylacja DNA. Modyfikacja chemiczna histonów reguluje poziom upakowania DNA i jego dostępność, natomiast metylacja DNA powoduje wiązanie się białek do konkretnych regionów DNA, co również wpływa na dostępność tych fragmentów dla maszynerii odpowiedzialnej za ich ekspresję. I faktycznie, oba te procesy wpływają na decyzję królowa vs. robotnica – np. sztuczne obniżenie poziomu jednego z enzymów odpowiedzialnych za metylację DNA powodowało pojawienie się cech charakterystycznych dla matek.

Podsumowanie (sfrustrowane)

Kończąc opisywanie mechanizmów odpowiedzialnych za determinację kast u pszczół, zdałam sobie sprawę ze swojej ogromnej frustracji – badania toczą się od ponad stu lat, a zrozumienie tego procesu wciąż nam umyka. Niby wiadomo, że jest on zależny od pokarmu, ale nie wiadomo, jakich konkretnie jego składników. Cukier jest ważny, ale chyba tylko jako bodziec stymulujący jedzenie. Mamy też zawarte w diecie mikroRNA i kwasy tłuszczowe – oba te czynniki wpływają bezpośrednio na ekspresję genów z pominięciem szlaków sygnałowych. Mamy chemiczną kastrację spowodowaną zjadaniem pyłku. Szlaki sygnałowe uruchamiane bodźcami zewnętrznymi – nawet wiemy jakie, ale może być ich więcej. Mechanizmy epigenetyczne – oczywiście, ale jak to się dzieje, że kontrolują tylko wybrane geny? Setki genów zmieniających ekspresję i to w dodatku na różnych etapach rozwoju larwy. Skład pokarmu zmieniający się w zależności od etapu rozwoju. Jeżeli odnosicie wrażenie, że jest to trochę nieskładna wyliczanka czynników, to jest to dobre wrażenie – mamy sporo elementów układanki, ale ułożenie z nich spójnego, pięknego obrazu zajmie jeszcze sporo czasu.

Idę coś zjeść, z dużą ilością cukru (chyba mi jeszcze zostały pączki z lukrem).

Może stanę się królową?