Czy biotechnolodzy, próbujący otrzymać komórki mózgu z komórek skóry, zachowują się podobnie jak alchemicy renesansu, którzy próbowali transmutować (przemienić) ołów w złoto?

Kim byli alchemicy?

Próby alchemików kończyły się niekiedy dość tragicznie. Starał się to uzmysłowić Pieter Brueghel Młodszy. Jak widać na poniższym obrazie, mąż rzekomo stara się przemienić (transmutować) jakiś metal w złoto. Oszust – udający nauczyciela – przekonuje rodzinę, że to się da zrobić. Żona nie ma już dla męża monet, które ten mógłby umieścić w naczyniu laboratoryjnym. W prawym górnym rogu obrazu widać projekcję tego, co czeka dzieci małżonków – przytułek. W dzisiejszych czasach przemiana (transmutacja) ołowiu w złoto jest wykonalna, ale zwyczajnie nieopłacalna. Ówczesnymi metodami nie było to możliwe.

Pieter Brueghel Młodszy „Alchemik”, ok. 1600 r. / DOMENA PUBLICZNA

Rycina 1

Współcześnie biotechnolodzy twierdzą, że z komórek skóry, np. keratynocytów, da się otrzymać komórki układu nerwowego np. neurony, a z komórek kości (osteoblastów) – komórki serca (kardiomiocyty) itp. Czy w związku z tym są oni alchemikami biologii? Czy mamią swoich inwestorów? Niektórzy takie zarzuty stawiali biotechnologom całkiem niedawno. Jakie bariery biotechnolodzy muszą pokonać, aby tego dokonać? Czy są to bariery równie trudne do pokonania, jak w czasie prób przemieniania (transmutacji) ołowiu w złoto?

Jakie bariery zabezpieczają przed przeobrażaniem się komórek jednego organu w komórki innego organu?

Wszystkie komórki w organizmie jednego człowieka mają ten sam genom (poza nielicznymi wyjątkami i abstrahuje się tutaj od komórek nowotworowych). Wydaje się więc, że nie powinno być wielkich problemów z przemianą komórki wątroby w komórkę skóry czy skóry w neuron (rozważając proces na tym poziomie sekwencji DNA). Wszystkie komórki mają pełen zestaw genów, pozwalających upostaciować się w dowolną komórkę organizmu. Jednak sekwencje DNA (genetyka) to nie wszystko. Wiele mechanizmów zapobiega takiej przemianie, przeobrażaniu się komórki w komórkę. Jeśli byłoby to możliwe, w naszych organizmach zapanowałby wielki chaos. Nagle w sercu pojawiłyby się komórki wątroby, a w mózgu – skóry. Pomimo więc, że w każdej komórce tego samego osobnika mamy ten sam genom (tę samą sekwencję DNA), komórki różnią się od siebie i istnieje bardzo wiele mechanizmów zapobiegających ich przemianie – przejściu fenotypowemu jednej komórki w drugą. Od czego zależy odmienny fenotyp komórek – ich odmienna budowa i funkcja, skoro wszystkie mają ten sam genom u jednego osobnika. W różnych komórkach ulegają ekspresji różne geny. W neuronie potrzebne do przewodnictwa, a w kardiomiocycie do kurczenia się. Dlaczego tak się dzieje? Decydują o tym najogólniej zjawiska epigenetyczne. Jedne fragmenty DNA w różnych komórkach (fibroblastach, neuronach, limfocytach itd.) są odkryte – dostępne dla maszynerii transkrypcyjnej (euchromatyna), a inne zakryte – niedostępne (heterochromatyna). Każda komórka ma swój wzorzec fragmentów DNA dostępnych i zakrytych dla maszynerii transkrypcyjnej. Ta dostępność lub jej brak zależy np. od metylacji DNA. Metylacja DNA jest modyfikacją bardzo trwałą. Nawet chromosomy (ich fragmenty) są inaczej położone w komórkach różnego typu. Te które są ukryte głębiej w jądrze nie są tak aktywne transkrypcyjnie (ich geny nie dochodzą do głosu), jak z tych chromosomów które są bliżej błony jądrowej. Z chromosomów bliżej błony jądrowej (czy ich fragmentów bliżej błony) łatwiej powstaje mRNA. Metylacja DNA czy położenie chromosomów w jądrze to więc przykłady różnic epigenetycznych, które zapobiegają spontanicznej czy przypadkowej przemianie jednej komórki w inną (np kardiomiocyta w komórkę wątroby). Właśnie zmiany w metylacji DNA, czy upakowania chromatyny, albo nawet położenia chromosomów w interfazowych jądrach komórkowych (jądra pomiędzy podziałami, mitozami) to zjawiska/procesy epigenetyczne. Różne rodzaje komórek mają charakterystyczne to wszystko, jak i inne wzorce epigenetyczne. DNA tych komórek ma taką samą sekwencję DNA, ale zachodzi w nich, w konsekwencji różnic epigenetycznych ekspresja innych genów. W komórkach kobiet jeden z chromosomów X jest tak ściśle upakowany, że transkrypcja w oparciu o jego DNA w ogóle nie jest możliwa. Proces który do tego prowadzi nazywa się lionizacją, a ten chromosom, który jest zlionizowany (zlyonizowany, zjawisko odkryła Mary F. Lyon) ciałkiem Barra. Czy wobec tego, próby zmieniania przez biotechnologów jednych komórek w inne, to zadanie tak samo beznadziejne, jak kiedyś zadanie alchemików? Okazuje się jednak, że nie. Chociaż można to zrobić raczej przez etap pośredni, wymagający otrzymania wszechstronnych komórek macierzystych, a nie bezpośrednio. Jak to jest możliwe i jak to się stało że biotechnolodzy przekonali świat, że nie są alchemikami, chociaż jeszcze dwadzieścia lat temu niektórzy coś takiego im zarzucali?

Obserwacje sugerujące, że można wymusić przeobrażenie komórki jednego typu w inną komórkę

Pierwsze zjawisko sugerujące, że jest to możliwe, zaobserwowano u płazów, takich jak salamandry czy aksolotle. U tych zwierząt możliwa jest bardzo sprawna regeneracja. Dochodzi do niej dzięki temu, że komórki dojrzałe – głównie fibroblasty – zachowują się tak, jakby „cofały się w rozwoju” do stanu komórki zarodkowej, czyli takiej, z której mogą powstać dowolne komórki organizmu. To dzięki temu, salamandrze odrośnie utracona kończyna. Zdolności regeneracyjne aksolotli są zadziwiające. Potrafią odtworzyć część mózgu. Jedno ze zjawisk, od którego to zależy, nie polega na bezpośrednim przejściu jednej komórki w drugą, ale na przejściu poprzez stan pośredni komórki macierzystej, czyli takiej, z której można otrzymywać różne komórki dojrzałe (poniżej opisano rodzaje komórek macierzystych). Procesowi temu towarzyszy proliferacja namnażania się komórek podobnych do zarodkowych (pluripotentnych komórek macierzystych). Dzięki temu w procesie odbudowy nie chodzi o przekładania cegieł (komórek) z jednej części organizmu salamandry w drugi i zmienianie jednego rodzaju w inny rodzaj cegieł, ale komórki z których powstają te cegły szybko się namnażają a potem dopiero do potrzebnych cegieł różnicują. Ludzie, czy ogólniej ssaki, nie mają niestety takich możliwości regeneracyjnych. Dlaczego ich nie mamy to temat na inny artykuł. Jednak kolejny sygnał, że bariery zabezpieczające przed przechodzeniem jednych komórek w inne nie są całkowicie szczelne, otrzymano w czasie badań ssaków. Wskazówka ta pojawiła się, kiedy próbowano klonować zwierzęta. Zauważono, że nawet u ssaków klonowanie jest możliwe. W czasie klonowania w komórce jajowej umieszcza się jądro komórkowe z komórki dojrzałej organizmu klonowanego. Mimo to (chociaż rzadko) proces klonowania udaje się nawet u ssaków (np. owca Dolly). Pojawia się tu jednak pytanie. Jak to jest możliwe, wobec tego, co opisano tu wcześniej? Przecież w trakcie klonowania w oocycie umieszcza się DNA z komórki dojrzałej – czyli takie, które jest zmienione chociażby metylacyjnie. Chromatyna jest upakowana, a chromosomy w jądrze interfazowym mają położenie charakterystyczne dla komórki dojrzałej, a nie zarodkowej. Generalnie to, co jest typowe dla komórek macierzystych zarodka, to generalne rozluźnienie chromatyny. DNA pobrane do klonowania to DNA jądrowe, konkretnej dojrzałej komórki, nie jest to DNA komórki zarodkowej w sensie jego statusu epigenetycznego. Co takiego znajduje się w oocycie, że taki proces klonowania i „odmłodzenia DNA” jest możliwy? 

Jak dokonano przeobrażenia komórek skóry czy osadu moczu w dowolne komórki człowieka?

Na powyższe pytanie – po eksperymentach prowadzonych metodą prób i błędów – próbowali odpowiedzieć Japończycy. Jeden z nich otrzymał nawet za te i późniejsze badania nagrodę Nobla. Japończycy doszli do wniosku, że oocyt nie może mieć jakiegoś magicznego sposobu „odmładzania DNA” komórki dojrzałej, tylko musi dysponować jakąś maszynerią, która to umożliwia. Wykorzystywali więc zestawy białek, działających w oocytach. Nie były to dowolne białka, ale tzw. czynniki transkrypcyjne. Stężenie tych białek podnosili w komórkach dojrzałych. Zmienili więc całkowicie podejście. To nie jądro (DNA) komórki dojrzałej umieszczali w oocycie, ale zwiększali stężenie wybranych białek, które działają w oocycie w komórkach dojrzałych. Zwiększania stężenia wybranych białek dokonali metodami inżynierii genetycznej. Po przetestowaniu dziesiątek zestawów białek, wyselekcjonowano zestaw czterech czynników transkrypcyjnych. Zestaw ten umożliwiał coś, co można porównać z „odmłodzeniem DNA” – zmienieniem np. jego statusu metylacyjnego z takiego obserwowanego w fibroblaście na taki, który występuje w komórce zarodkowej (pluripotentnej). Później okazało się, że ten zestaw czynników transkrypcyjnych inicjował tak poważne zmiany epigenetyczne, że po dłuższym czasie (miesiące) w komórkach żeńskich nawet ciałko Barra (zlionizowany chromosom X) ulegało reaktywacji transkrypcyjnej. „Udało się więc nawet odsupłać chromosom X zmieniony w ciałko Barra, chociaż ten był prawie tak zasupłany jak węzeł gordyjski”. Komórka dojrzała przyjmuje więc fenotyp/zdolności komórki zarodkowej. Proce lionizacji losowo wybranego chromosomu X kończy się na tym etapie zarodkowym, kiedy u człowieka występują około 64 komórki. W tym momencie istniejące komórki mogą zmienić się (zostać zróżnicowane) do właściwie dowolnej z ponad 200 typów komórek człowieka, ale nie mogą już być zalążkiem (różnicować się do) całego organizmu. Nie można więc powiedzieć, że komórka taka jak komórka wątroby, przeszła bezpośrednio w komórkę układu nerwowego w wyniku tego typu działań. Dzieje się to poprzez wykorzystanie etapu pośredniego, w którym pojawiła się wszechstronna komórka macierzysta. Opisany tu w uproszczeniu proces przeprowadzenia komórki dojrzałej w komórkę zarodkową (konkretnie indukowaną pluripotentną komórkę macierzystą) nazwano reprogramowaniem. W praktyce nie jest to literalnie cofanie się krok po kroku komórki do stanu zarodkowego, ale pewnego rodzaju reset epigenetyczny (zmiana statusu metylacyjnego DNA, upakowania chromatyny, położenia chromosomów w jądrze interfazowym itp). W procesie tym mogą być wykorzystane nawet komórki znajdujące się w osadzie moczu. Otwiera to oczywiście różne możliwości terapeutyczne. Dzięki temu, otrzymać można komórki autologiczne (od samego dawcy), przydatne w transplantologii. Komórki takie nie będą odrzucane, tak jak allogeniczne (od innego dawcy).

Rycina 2. Kolonia komórek iPSc otrzymana z komórek osadu moczu. Widoczna w mikroskopie fluorescencyjnym i po barwieniu immunocytochemicznym (ICC). Po zastosowaniu ICC widoczne są sygnały wynikające z obecności białek (OCT4, SOX-2) przeprowadzających (reprogramujących) komórki dojrzałe w komórki macierzyste (iPSc) i będących markerami komórek macierzystych. Z kolekcji zdjęć zespołu, w którym pracuje autor publikacji.

Więcej przykładowych wyników i wyjaśnień, chociażby w publikacji, której autor tego tekstu jest współautorem. W publikacji pokazano jak otrzymać pluripotentne komórki macierzyste z komórek skóry i osadu moczu. Generation of human iPSCs from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system | Stem Cell Research & Therapy | Full Text (biomedcentral.com). Próbuje się także prowadzić innego rodzaju przekształcenia różnych komórek w zupełnie inne. Odkryto inne sposoby reprogramowania komórek dojrzałych do indukowanych komórek pluripotentnych. Opisany tu proces reprogramowania komórek dojrzałych do indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych jest jednak najlepiej poznany i dość skuteczny.

Podsumowanie

Porównanie przemienienia ołowiu w złoto do przemiany np. komórki nerwowej w komórkę wątroby jest bardzo luźne. Po pierwsze występuje w biologii bardzo specyficzny etap pośredni – komórka, z której można otrzymać dowolne komórki organizmu. Jest jeszcze jedna ważna różnica między biotechnologiczną a fizykochemiczną przemianą. Wydajność procesu przeprowadzania komórki dojrzałej w komórkę podobną do zarodkowej jest bardzo niska. Jest to mniej, niż promil komórek poddawanych wpływowi czynników transkrypcyjnych (komórek pobranych ze skóry czy z osadu moczu).Tylko że biotechnologowi to nie przeszkadza. Bo nawet jedna otrzymana komórka macierzysta (iPSc) namnaża się in vitro i tworzy łatwe do wyodrębnienia kolonie (rycina 2), a atom złota otrzymany za wielką cenę z atomu ołowiu namnażał się nie będzie. Czy biotechnolodzy są więc jak alchemicy z obrazu Pietera Brueghela Młodszego? Nie, biotechnolodzy nie kłamią, że z komórek dojrzałych (w tym z komórek osadu moczu) da się otrzymać komórki macierzyste, z których można właściwie później uzyskać dowolne komórki organizmu. Jakkolwiek otrzymywanie neuronów czy kardiomiocytów z komórek osadu moczu czy skóry, nawet z uwzględnieniem etapu pośredniego (komórek macierzystych iPSc), może zakrawać na coś nieprawdopodobnego, to robi się to już właściwie rutynowo. Proces ten powoli zaczyna znajdować zastosowanie w medycynie. Coraz trudniej jest w otaczającym nas świecie odróżnić obietnice bez pokrycia od tych, które zostaną zrealizowane.

Rodzaje komórek macierzystych u człowieka:

Totipotentne komórki macierzyste. Są to komórki, z których można otrzymać cały organizm. W przypadku człowieka są to komórki od zygoty do moruli. Zygota to jedna komórka. Morula to 16 komórek (blastomerów).

Pluripotentne komórki macierzyste. Są to komórki, które można zróżnicować do dowolnych komórek organizmu, ale nie można już otrzymać całego organizmu.

Multipotentne komórki macierzyste. Są to komórki, z których można otrzymać pewną grupę komórek dojrzałych. Przykładowo z hematopoetycznej komórki macierzystej można otrzymać komórki krwi. Z neuralnej komórki macierzystej można otrzymać głównie neurony, astrocyty i oligodendrocyty.

Witamina B12: kłopotliwa spuścizna ewolucji (3)

Jak powstaje witamina B12?

W poprzednim wpisie napisałem o tym, do czego potrzebna jest witamina B12 oraz w jaki sposób jest wchłaniana w naszym organizmie. Ale skąd się bierze? Biorąc pod uwagę złożoną budowę kobalaminy, jej otrzymanie na drodze syntezy chemicznej było nie lada wyzwaniem. Ale w roku 1976 zespołom Alberta Eschenomosera z Politechniki w Zurychu i Roberta Woodwarda (Harvard University) udało się dokonać syntezy witaminy B12. Prekursorami były proste substancje, takie jak etylometyloketon, butadien czy kamfora. Synteza wymagała 70 kroków i zajęła 11 lat, a pracowało przy niej ponad 100 osób. Był to ogromny sukces chemików-organików, którzy pokazali, że są w stanie zsyntetyzować i oczyścić tak skomplikowaną cząsteczkę. Komercyjnie nie miało to jednak większego sensu, bo okazało się, że bakterie są w stanie produkować witaminę B12 o wiele taniej. Dziś jest ona produkowana na skalę przemysłową właśnie przez bakterie, przede wszystkim przez genetycznie zmodyfikowany szczep Pseudomonas denitrificans. Witamina B12 powstaje w ramach procesu składającego się z 30 kroków (to znaczy, tyle enzymów potrzeba, żeby przetworzyć substancje wyjściowe, takie jak bursztynylo-CoA i glutaminian w końcowy produkt). Oczywiście konieczny jest dodatek soli kobaltu, bo bez niego witamina B12 nie powstanie. Produkcja zachodzi w temperaturze 30oC w fermentorach o objętości 120 m3 w ciągu 7-8 dni, a końcowe stężenie kobalaminy to ok. 150 mg/litr. Pożywka to ekstrakt drożdżowy i sacharoza. Po oczyszczeniu i krystalizacji witamina jest gotowa do użycia.

W 2023 r. przedstawiono metodę syntezy kobalaminy w tzw. systemie „cell-free” (to znaczy, bez udziału komórek), za pomocą enzymów wyprodukowanych przez genetycznie modyfikowane bakterie Escherichia coli. Geny kodujące te enzymy uzyskano z bakterii należących do 26 gatunków bakterii (jak np. Salmonella typhimurium, czy Bacillus subtlis), a enzymów było w sumie 36. Substancją wyjściową był kwas 5-aminolewuliowy. Reakcja zachodziła w ciągu 14 godzin, zastosowano 4 etapy syntezy (to znaczy, czterokrotnie zmieniano zestawy enzymów), a końcowe stężenie kobalaminy wynosiło 5 mg/litr. Być może taka jest właśnie przyszłość biotechnologii: synteza skomplikowanych związków za pomocą uprzednio otrzymanych enzymów (Ryc. 1)?

Ryc. 1. Schemat syntezy witaminy B12 za pomocą enzymów otrzymanych w genetycznie modyfikowanych bakteriach Escherichia coli.  Źrodło: Kang Q. et al., Nature 2023, 14:5177. Licencja CC BY 4.0.

Czym grozi nam brak witaminy B12?

Zapotrzebowanie dorosłego człowieka na witaminę B12 wynosi ok. 2,4 µg dziennie (u kobiet w ciąży i karmiących piersią nieco więcej). W porównaniu do innych witamin jest to stosunkowo niewiele: zapotrzebowanie na witaminę B1  to ok. 1 mg/dobę, a witaminę B3  ok. 15 mg/dobę. W organizmie człowieka (głównie w wątrobie) jest ok. 3 mg witaminy B12, co stanowi kilkuletni zapas. Uważa się jednak, że ok. 1-2% populacji w krajach rozwiniętych (dużo więcej w krajach biednych) cierpi na niedobór witaminy B12. Ze wzglądu na spory zapas tej witaminy w wątrobie, objawy takiego niedoboru mogą pojawić się dopiero po kilku latach.

Najczęstszym skutkiem tego niedoboru są zaburzenia układu nerwowego oraz anemia złośliwa, zwana też niedokrwistością Addisona-Biermera. Jej objawy to obniżenie liczby erytrocytów i poziomu hemoglobiny, a także wzrost objętości krwinki czerwonej (mean corpuscular volume, MCV) Pojawiają się też neutrofile o charakterystycznie rozczłonkowanym jądrze, co jest dobrze widoczne w rozmazie krwi. Przyczyną jest upośledzenie syntezy nukleotydów wchodzących w skład DNA: jeżeli ich brakuje, komórki nie mogą zakończyć podziałów komórkowych, co powoduje wzrost objętości komórek. Komórki takie, nazywane megaloblastami, są obecne w krwiobiegu u osób dotkniętych tą chorobą.

Jaka jest przyczyna tego zjawiska? Do syntezy DNA potrzebne są nukleotydy, które nie powstaną bez udziału witaminy B12 oraz kwasu foliowego. Jeżeli ich brakuje, wzrost komórek oraz ich podziały zostają wstrzymane. Dotyczy to przede wszystkim komórek, które najszybciej się dzielą, a do takich należą komórki szpiku, w którym powstają krwinki czerwone. Dlatego w warunkach niedoboru witaminy B12 produkcja erytrocytów spada.

Niedobór witaminy B12 może też powodować zmiany w układzie nerwowym dające objawy neurologiczne, które zazwyczaj poprzedzają objawy ze strony układu krwiotwórczego. Są to zaburzenia czucia, mrowienie w końcach palców, osłabienie, zaburzenia równowagi, a później także zaburzenia poznawcze, apatia i stany depresyjne.

Dlaczego może brakować witaminy B12?

Jeżeli spożywamy wystarczającą ilość witaminy B12, to przeważnie przyczyną jest niedobór czynnika wewnętrznego, który jest produkowany przez komórki żołądka. Czynnika tego może brakować w sytuacji, kiedy komórki żołądka ulegają zniszczeniu przez układ odpornościowy. Dzieje się tak w przypadku chorób autoimmunizacyjnych, czyli wtedy, gdy komórki układu odpornościowego niszczą inne komórki (w tym przypadku, komórki okładzinowe żołądka).  Resekcja żołądka, np. w wyniku choroby nowotworowej, też uniemożliwia przyswajanie witaminy B12 na drodze pokarmowej.

Niedobór witaminy B12 zdarza się też u osób stosujących dietę wegańską, ponieważ pokarmy roślinne jej na ogół nie zawierają. Wyjątkiem są niektóre glony, a także grzyby, jak np. shitake czy kurki (grzyby to nie rośliny). Kobalamina jest w nich pochodzenia bakteryjnego. Dlatego w diecie wegańskiej zaleca się suplementację witaminy B12­. Gorzej jest w przypadku braku czynnika wewnętrznego: jedyna rada wówczas to domięśniowe zastrzyki z witaminy B12.

Również przewlekłe choroby układu pokarmowego, jak celiakia czy choroba Leśniowskiego-Crohna mogą powodować upośledzone wchłanianie witamin B12. Niektóre leki, jak pochodne metforminy stosowane w leczeniu cukrzycy albo inhibitory pompy wodorowej stosowane w leczeniu żołądka też mogą powodować takie skutki.

Niedobór witaminy B12 zdarza się też w przypadku zakażenie tasiemcem (np. bruzdogłowiec szeroki, Diphyllobothrium latum). Jest tak dlatego, że tasiemiec, jak każde zwierzę, potrzebuje witaminy B12 i zabiera ją gospodarzowi.

Czy nadmiar witaminy B12 może być szkodliwy? Raczej nie, bo skomplikowany system wchłaniania z udziałem wielu białek powoduje, że „nadmiarowa” witamina jest wydalana z moczem.

Dlaczego potrzebujemy witaminy B12, skoro rośliny i grzyby radzą sobie bez niej?

Nie da się ukryć, że witamina B12 jest dla nas problematyczną cząsteczką. Nie możemy jej syntetyzować, wchłanianie jest skomplikowanym procesem wymagającym wielu białek, a jedynym źródłem są pokarmy pochodzenia zwierzęcego. A co z roślinożernymi zwierzętami? U przeżuwaczy, takich jak krowy lub owce, kobalamina jest produkowana przez bakterie w komorze żołądka zwanej żwaczem. Warunkiem jest jednak obecność soli kobaltu w glebie, na której rośnie trawa służąca jako pasza. W niektórych regionach Australii i Nowej Zelandii stwierdza się chorobę owiec o nazwie  choroba buszu (bush sickness), która jest spowodowana niedoborem kobaltu w glebie. Bakterie ze żwacza, przy całej ich sprawności w syntezie kobalaminy, nie są w stanie wyprodukować jej bez kobaltu. Objawy są podobne do anemii złośliwej (Ryc. 2).

Ryc. 2. Owce z niedoborem kobaltu („bush sickness”). Źródło: Wikipedia. Licencja CC BY 4.0.

Inne roślinożerne zwierzęta (te, które nie są przeżuwaczami, czyli np. króliki czy bobry) radzą sobie zjadając własne odchody. Wchłaniają w ten sposób witaminę B12 wyprodukowaną przez bakterie żyjące w ich jelicie grubym. Bakterie z naszego jelita grubego też produkują witaminę B12, ale nie możemy jej wchłaniać, bo jelito kręte znajduje się przed jelitem grubym. Jest to jeden z paradoksów związanych z tą witaminą.

A w jaki sposób witamina B12 powstała miliardy lat temu? O tym w następnym wpisie.

Literatura dodatkowa

https://www.nature.com/articles/s41467-023-40932-4

Synteza witaminy B12 za pomocą 36 enzymów bakteryjnych

https://www.nature.com/articles/s41467-023-40932-4

Czy biotechnolodzy tworzą coś nowego, czy kradną naturze?

Jak powiedział Picasso: „Dobrzy artyści kopiują, wielcy kradną.” Podobnie wyrażali się między innymi: Igor Stravinsky, T.S. Eliot czy Steve Jobs.

Te słowa nie są jednak pochwałą kradzieży, ale zachętą do pokory i szacunku wobec tych, którzy tworzyli coś wcześniej. Zachętą do przyznania, że coś stworzone wcześniej było co najmniej inspiracją dla kolejnych pokoleń artystów. Przykładem jest las Birnam z Makbeta Szekspira, który inspirował Tolkiena przy opisie ataku Entów (pasterzy drzew) na Isengard.

Czy biotechnolodzy kradną (plagiatują) w takim sensie? Podobnie, jak artyści obserwują efekty pracy innych artystów, również biotechnolodzy obserwują pracę innych biotechnologów. Pojęcie „patentów” w sztuce (poza muzyką) bywa trudne do zdefiniowania – nie patentuje się obrazów. W biotechnologii jest o patenty trochę łatwiej. Mimo to urzędy patentowe ze zmienną konsekwencją przyznają lub nie prawa patentowe (własności intelektualnej) kolejnym projektantom. Jednak biotechnolodzy i artyści „plagiatują” jeszcze inaczej. „Plagiatują” naturę, a ta nie pójdzie oczywiście do sądu. Okazuje się jednak, że ma ona swoich rzeczników w urzędach patentowych w kwestiach biotechnologicznych. Przez wiele lat w urzędach patentowych trwał wielki spór o to, na ile rozwiązania podpatrzone w naturze mogą być patentowane. Rzecznicy patentowi wyznaczyli pewne kryteria, po spełnieniu których patent zostanie przyznany. Natomiast, biorąc pod uwagę cytat z Picassa, wobec kogo czy czego taki „złodziej biotechnolog” powinien taki rodzaj szacunku okazać?

Przeciwciała, enzymy do testów PCR, plazmidy, wektory wirusowe, nagrodzony Noblem CRISPR, promotory, sekwencje nukleotydowe czy aminokwasowe i wiele innych „rzeczy”, „ukradli” wirusom i bakteriom (na końcu tekstu znajduje się glosariusz wyjaśniający używane terminy biotechnologiczne). Po co…? Wcześniej chociażby po to, by produkować białka terapeutyczne i diagnostyczne. Ostatnio wszystko to, czego trochę nakradli, składają jak klocki lego w zupełnie nowe twory terapeutyczne, nazywając to już nie biotechnologią, a biologią syntetyczną.

Plazmidy służą bakteriom do tworzenia np. białek antybiotykooporności. Biotechnolodzy zamienili te fragmenty DNA w plazmidach w transgeny do produkcji białek potrzebnych ludziom – chociażby do produkcji insuliny dla chorych na cukrzycę. Nie dość, że ukradli bakteriom pomysł, to jeszcze go wykorzystują do produkcji np. leków.

Polimerazowa reakcja łańcuchowa (PCR), która stała się powszechnie znana w czasie pandemii COVID-19, to również w pewnym sensie zasługa bakterii. Jedne z nich, aby żyć w gorących źródłach Yellowstone „wymyśliły” białka, w tym polimerazę, które są w stanie przetrwać w wysokich temperaturach, a to dzięki niej możliwe jest szybkie prowadzenie PCR. W czasie tej reakcji temperatura wielokrotnie osiąga ponad 90 stopni Celsjusza, a większość molekuł polimerazy nie może ulec denaturacji. Oczywiście biotechnolodzy – za pomocą plazmidów z transgenem – zmuszają zwykłe bakterie (głównie E.coli) do produkcji tej polimerazy. Kradną polimerazę z jednych bakterii, a inne zmuszają do niewolniczej produkcji.

Skąd się wzięła odwrotna transkryptaza potrzebna, aby przepisać RNA (wirusa takiego jak SARS-CoV-2) na DNA przed reakcją PCR? Również ona została „skradziona”, tym razem wirusom.

Technologia CRISPR, nagrodzona nagrodą Nobla w 2020 roku, służąca obecnie np. do naprawy uszkodzonych genów, wywodzi się z systemu bakteryjnego, którym bakterie zwalczają swoich wrogów, wirusy bakteryjne – bakteriofagi. Pierwsza terapia oparta o CRISPR do leczenia osób z chorobą genetyczną – chorobą sierpowatokrwinkową – została zarejestrowana przez FDA w 2023 roku. System, z którego wywodzi się CRISPR/Cas chroni bakterie przed ich wirusami – to „element układu odpornościowego bakterii”. Bakterie tworzą „biblioteki” fragmentów genomów fagowych, aby wtedy, kiedy któryś znowu zaatakuje, zniszczyć go. Tworzenie bibliotek fragmentów genomów fagowych w genomie bakteryjnym jest więc przez niektórych autorów określane mianem budowania pamięci immunologicznej. Natomiast biotechnolodzy wykorzystują CRISPR/Cas do naprawy genomu np. w ludzkich komórkach. Widać więc, że podpatrywanie natury miało miejsce, ale zastosowanie rozwiązania Cas9 z zaprojektowanym fragmentem RNA jest już zupełnie inne. Powstają kolejne metody edycji genomu, takie jak prime editing, w których podkrada się naturze coraz więcej. Nie wolno robić edycji genomu na poziomie komórek linii germinalnych czy komórek zarodkowych człowieka, ale wolno na poziomie komórek somatycznych (dojrzałych i multipotentnych macierzystych).

Biotechnolodzy równocześnie próbują wykorzystać również naturalnego wroga bakterii, jakim są bakteriofagi, po to, żeby bakterie zwalczać. Jest to szczególnie ważne wobec pojawiającej się antybiotykoodporności. Rozwiązanie takie zaczyna być stosowane w produkcji żywności, ponieważ stosowanie antybiotyków chociażby w uprawach roślin czy hodowli drobiu to jedna z głównych przyczyn pojawiania się antybiotykoodporności.

Jak widać, bardzo wiele systemów wykorzystywanych przez biotechnologów powstało w trakcie walki organizmów z ich patogenami. Co nie powinno dziwić, bo taka walka jest akceleratorem ewolucji, a zatem tworzenia coraz doskonalszych rozwiązań.

Nie jest to jednak jedyne źródło, z którego pozyskuje się narzędzia czy technologie.

Biotechnolodzy wykorzystują bakterie (np. Agrobacterium tumefaciens), aby tworzyć rośliny GMO. Normalnie bakterie te infekują rośliny i wprowadzają swoje geny, żeby pozyskiwać od roślin opiny.

Wektory wirusowe stosowane np. w terapii genowej to wykorzystanie ułomnych czynników infekcyjnych, które w formie kompletnej infekują np. komórki ludzi, a u biotechnologów infekują komórki, aby wprowadzić do nich to, co chcą w nich umieścić. Jeśli chcemy zastosować wspomniany wcześniej CRISPR/Cas, to także najczęściej wykorzystujemy wirusy jako wektory tego systemu. Jeśli chce się wprowadzić „transgen leczniczy”, to również tak to się odbywa.

Bakterie, aby walczyć z bakteriofagami, „wymyśliły” – podobnie (jak CRISPR/Cas) – enzymy restrykcyjne. Biotechnolodzy korzystają z nich notorycznie, aby tworzyć wektory do produkcji np. białek leczniczych. Paradoksalnie system, który miał chronić bakterie przed ingerencją w ich DNA, służy do zmieniania ich DNA plazmidowego.

Bakteriofagi posiadają natomiast specjalne rekombinazy, umożliwiające wprowadzanie ich genów do genomu bakterii. Biotechnolodzy zastąpili tym systemem fagowym enzymy restrykcyjne, aby skonstruować/wygenerować system gate way – bramkowania − i szybciej przenosić między plazmidami np. transgeny lecznicze.

Biotechnolodzy w ogóle bardzo często korzystają z rozwiązań powstających w trakcie ewolucji wirusów. Genomy wirusów są bardzo małe, gdyż od upakowania na małej przestrzeni wielu informacji zależy ich przetrwanie. Biotechnolodzy również muszą upakowywać dużo informacji na małej przestrzeni, co wynika z niuansów technicznych ich pracy.

Wirusy „wymyśliły” więc np. sekwencję IRES, która pozwala otrzymywać z jednego fragmentu mRNA coś, co u eukariotów jest kodowane przez kilka genów. Wirusy geny zastąpiły czymś, co nazywa się otwartymi ramkami odczytu. Nie ma potrzeby, żeby kontrolować pojawianie się białek wirusowych w tak skomplikowany sposób, jak np. w komórkach człowieka. Zazwyczaj wszystkie białka wirusowe mogą, a nawet powinny pojawiać się równocześnie, aby doszło do samoskładania wirionów. W przypadku komórek człowieka tak nie jest. Istnieje wąska specjalizacja. To między innymi dzięki temu, pomimo że w każdej komórce jednego człowieka jest w zasadzie ten sam genom, mamy ponad 200 rodzajów komórek.

Podobnie jak IRES, peptydy (sekwencje) F2A czy P2A pozwalają wirusom na tworzenie wielu białek z jednej cząsteczki mRNA. Biotechnolodzy „plagiatują” te rozwiązania, aby również otrzymywać kilka białek z jednego fragmentu RNA. W tym przypadku rybosom po zakończeniu translacji jednego białka przeskakuje niejako do translacji następnego. IRES pozwala przyłączać się rybosomom w kilku miejscach mRNA i inicjować translację.

Wirusy regulują transkrypcję (przepisywanie DNA na RNA) za pomocą bardzo małych fragmentów regulacyjnych i w ten sposób wymuszają produkcję swojego RNA w komórkach ssaków. Te małe elementy regulacyjne z wirusów SV-40 czy CMV również zostały wykorzystane przez biotechnologów.

Oczywiście nie wyczerpuje to wszystkich elementów, które są plagiatowane z organizmów żywych przez biotechnologów.

Ponadto nie wszystkie rozwiązania pochodzą ze świata patogenów.

Przeciwciała wykorzystywane np. w diagnostyce normalnie służą do zwalczania patogenów. Biotechnolodzy wytwarzają je do: testów onkologicznych, wirusowych (kupujemy je w aptece), a nawet do testów ciążowych. To rozwiązanie układu odpornościowego różnych zwierząt. Ostatnio plagiatują je np. od alpak, ale również od rekinów, gdyż te mają dość sprytne (bardzo małe) przeciwciała.

Szczepionki to również zaprzęgnięcie do działań człowieka naturalnego systemu odpornościowego. Do ich tworzenia wykorzystywane są plazmidy, wektory wirusowe itp., opisane wcześniej. W naturze cena nabywania odporności jest bardzo wysoka. Często jest to kalectwo, niekiedy śmierć członków społeczności.

Przeciwnowotworowa terapia CAR-T jest wspólnym dziełem natury, biotechnologów i immunologów. Polega na połączeniu odpowiedzi limfocytów T i limfocytów B. Skradziono więc układowi odpornościowemu dwa rozwiązania i stworzono ich funkcyjną chimerę przy okazji tworzenia chimerowego białka. Powstała komórka, która nie wymaga prezentowania antygenu na cząsteczkach HLA (MHC), ale rozpoznająca go bezpośrednio. Pozwala to uniknąć niektórych działań, komórek nowotworowych, których one dokonują, aby „zmylić” układ odpornościowy. Litera C w nazwie CAR-T pochodzi właśnie od chimerowy (ang. chimeric).

CAR-T to przykład nowego świata biotechnologii, czyli biologii syntetycznej. W tym świecie biotechnolodzy tworzą nowe byty np. komórkowe, ale również kradną istniejące w przyrodzie elementy regulatorowe, białka itp. Również białka używane do edycji (naprawiania) genów w ramach metod nowocześniejszych niż CRISPR, takich jak prime editing, to białka chimerowe. Podbieranie elementów ze świata przyrody to pierwszy etap. Kolejny − to tworzenie z nich nowych, nieistniejących w przyrodzie bytów, takich jak komórki. Układy te są na tyle skomplikowane, że zaczyna się je porównywać do układów scalonych. Jest to dość luźna analogia, ponieważ komórka ma inną organizację przestrzenną niż układ scalony, ale obrazuje złożoność zmian, które biologia syntetyczna oferuje.

Na czym więc bardzo często polega biotechnologia czy biologia syntetyczna? Polega na podpatrywaniu natury i wykorzystywaniu jej wynalazków w innych celach niż te, dla których natura je wytworzyła. Sposoby korzystania z tych wytworów stają się coraz bardziej wyrafinowane. Najczęściej korzysta się z tego, co powstało w ramach ewolucyjnego wyścigu zbrojeń między bakteriofagami, a bakteriami, czy między naszym układem odpornościowym, a patogenami.

Glosariusz z wyjaśnieniami ( w celach popularyzacji)

PCR − łańcuchowa reakcja polimerazy, PCR (od ang. polymerase chain reaction)

Metoda powielania dwuniciowych fragmentów DNA. W trakcie reakcji odbywa się od 25 do 40 cykli, w czasie których dochodzi do kopiowania wybranego fragmentu DNA temperatura zmienia się od 45 do 95 stopni Celsjusza.

Odwrotna transkryptaza

Polimeraza DNA zależna od RNA, umożliwia syntezę nici DNA, wykorzystując jako matrycę RNA. Enzym ten w naturze kodowany jest w otwartych ramkach odczytu retrowirusów. Proces, w którym bierze udział ten enzym, nosi nazwę odwrotnej transkrypcji.

Metoda CRISPR/Cas (ang. Clustered Regularly−Interspaced Short Palindromic Repeats, pol. zgrupowane, regularnie rozproszone, krótkie, powtarzające się sekwencje palindromiczne)

Metoda ta pozwala na edycję genomu organizmu, który posiada odpowiedni system naprawy uszkodzeń DNA (Eukaryota). Mechanizm immunologiczny, z którego wywodzi się ta metoda: u bakterii odpowiedni RNA umożliwia niszczenie genomu fagów dzięki enzymom Cas. Enzymy Cas rozcinają DNA bakteriofagów rozpoznany przez to RNA. Biotechnolodzy wprowadzają transgen kodujący sgRNA, przypominający funkcyjnie RNA z bakteryjnego CRISRP razem z transgenem kodującym Cas (najczęściej Cas9), do komórek eukariotycznych. W tych komórkach, w przeciwieństwie do komórek prokariotycznych, może dochodzić do naprawy uszkodzeń DNA, powodowanych przez Cas9 naprowadzony przez sgRNA na odpowiednie miejsce DNA. sgRNA jest kodowany oddzielnym transgenem regulowanym przez promotor taki jak np. U6 (przyłącza on odpowiednią polimerazę). Sekwencja CRISPR w naturze zawiera fragmenty genomów bakteriofagów, które bakteria wcześniej zwalczyła. Dlatego CRISPR to część systemu ochrony przed bakteriofagami. Na tym przykładzie widać, jak bardzo biotechnolodzy zmieniają pierwotne zastosowanie jakiegoś rozwiązania działającego w naturze.

PE prime editing − zastosowanie edycji prime

Metoda wywodzi się z CRISPR/Cas. Wykorzystuje się w niej jednak białko chimerowe mutanta Cas9 (H840A) połączone z domeną odwrotnej transkryptazy. Powstało pięć (a nawet siedem, uwzględniając NPE i TPE) kolejnych odmian tej metody. Metoda pozwala na uniknięcie niektórych błędów pojawiających się w czasie edycji genomu metodą CRIPSR/Cas tzw. INDELS niechciane insercje, delecje.

Sekwencje 2A (F2A, P2A)

Sekwencje kodujące peptydy 2A pochodzą z genomów wirusowych. Umieszczenie ich pomiędzy sekwencjami DNA (potem RNA) kodującymi dwa różne białka powoduje, że rybosom w czasie translacji po ukończeniu syntezy pierwszego białka niejako przeskakuje do syntezy następnego białka. W ten sposób biotechnolodzy mogą umieścić w wektorach sekwencje kodujące więcej niż jedno białko − transgen(y)/otwarte ramki odczytu, których ekspresja jest regulowana przez jeden promotor.

IRES

Skrót pochodzi od ang. internal ribosome entry site. To element RNA pozwalający inicjować translację w sposób niezależny od czapeczki mRNA 5’. IRES pozwala rybosomom zacząć syntezę w kilku miejscach jednego fragmentu (jednej molekuły) mRNA. W przeciwieństwie do P2A, IRES umożliwia startowe przyłączenie rybosomu w miejscu, gdzie występuje sekwencja charakteryzująca ten fragment RNA. Peptyd 2A ujawnia swój efekt, kiedy dojdzie do translacji białka zakończonego tą sekwencją peptydową. Wtedy ten rybosom, który ten fragment zsyntetyzował, podejmie syntezę kolejnego białka dzięki temu, że molekuła RNA, na której się znajduje, zawiera sekwencję kodującą kolejny peptyd.

Promotor SV-40, promotor CMV

Rozpoczęcie transkrypcji (proces syntezy RNA na matrycy DNA) u ssaków jest precyzyjnie regulowane. Wirusy DNA wykorzystują krótkie sekwencje, aby ten proces uruchomić. Do tych fragmentów DNA przyłączają się czynniki transkrypcyjne, do których przyłącza się polimeraza RNA. Popularne wśród biotechnologów ze względu na niewielki rozmiar są fragmenty (sekwencje) pochodzące z wirusów SV-40 i CMV.

CAR-T

Skrót określający limfocyty T, do których metodami inżynierii genetycznej wprowadzono transgen kodujący białka CAR, ang. chimeric antigen receptor). Białko to składa się z kilku domen, które bez ingerencji człowieka należą do kilku białek. W typowym CAR jest to domena scFv (ang. single-chain variable fragment) i domeny należącej do białek, które w limfocytach T transdukują (przekazują) sygnał umożliwiający zabijanie np. komórek zainfekowanych przez wirusa (CD28, 4-1 BB, CD3z itp). Typowy scFv to fragment zmienny łańcucha lekkiego i ciężkiego konkretnego przeciwciała połączony odpowiednim peptydem/linkerem. Takie działanie pozwala komórkom CAR-T eliminować komórki nowotworowe, które wykazują ekspresję genu kodującego białko rozpoznawane przez domenę scFv. Same przeciwciała nie wykazują takiej skuteczności jak CAR-T. Analogicznie skrót CAR-M będzie oznaczał makrofagi, do których wprowadzono transgen kodujący białko CAR.

Transgen, gen, otwarta ramka odczytu (ORF)

Określenie transgen zostało zarezerwowane w tym tekście dla sekwencji kodujących umieszczanych w odpowiednich wektorach przez człowieka. Natomiast gen tutaj to fragment genomu kodujący białko czy RNA, który powstał w naturze. Autor zdaje sobie sprawę że gen bakteryjny w plazmidzie (nie chromosomie bakteryjnym) nie różni się zasadniczo od transgenu bakteryjnego. Zdecydowano się jednak na rozróżnienie gen vs. transgen, ponieważ większość fragmentów kodujących umieszczanych w wektorach np. wirusowych, a opisanych w tym tekście, odnosi się do genomu człowieka. W przypadku Eukaryota ekspresja genu jest regulowana za pomocą promotora, wzmacniaczy, wyciszaczy, a pierwotny transkrypt ulega splicingowi. Transgen takiego genu ma natomiast sztuczny względem oryginalnego promotor (patrz promotor CMV/SV40), co zmienia sposób regulacji jego ekspresji. Gen u eukariotów położony jest w konkretnym miejscu genomu, transgen tego genu wprowadzony do genomu ludzkiego za pomocą np. wektorów wirusowych zazwyczaj ma położenie przypadkowe. Te różnice powodują np., że edycja genomu (konkretnego genu) w celach terapeutycznych jest rozwiązaniem bardziej pożądanym niż tradycyjna terapia genowa oparta o transgen. Różnic między genem a transgenem jest więcej. Termin otwarta ramka odczytu (ang. open reading frame ORF), został tu użyty w odniesieniu do genomów wirusowych i transgenów. W przypadku genomu wirusa jedna molekuła mRNA dostarcza kilku otwartych ramek odczytu − fragment kwasu nukleinowego wirusa, na bazie którego powstaje jedna cząsteczka mRNA koduje kilka białek. W tekście użyto tych trzech określeń dla fragmentów kwasów nukleinowych kodujących głównie białka. Gen czy transgen nie musi jednak kodować białka. Jak wskazano, sgRNA używane w metodzie CRISPR, czy PE (pegRNA), jest również kodowane przez transgen. W wektorach przygotowywanych przez biologów również pojawiają się odcinki DNA kodujące mRNA dla kilku białek właśnie dzięki wykorzystaniu rozwiązań pochodzących z genomów wirusowych.