W poprzednim wpisie napisałem o sprawie Kathleen Folbigg, która została oskarżona o zamordowanie czwórki swoich dzieci i przesiedziała 20 lat w więzieniu. Dzięki badaniom genetycznym udało się wykazać, że dzieci zmarły z powodu rzadkich mutacji genetycznych. Jedna z nich dotyczyła kalmoduliny, białka wiążącego jony wapnia i odgrywającego dużą rolę w skurczu mięśnia.
Jak działają mięśnie prążkowane?
Jak wiemy ze szkoły, mięśnie dzielą się na gładkie i prążkowane, a te ostatnie dodatkowo na szkieletowe i wchodzące w skład mięśnia sercowego. Skurcz mięśnia prążkowanego następuje w wyniku wzajemnego przesunięcia kompleksów białkowych nazywanych filamentami. Są ich dwa rodzaje: cienkie i grube. W skład cienkich wchodzą następujące białka: aktyna, troponiny (są ich trzy rodzaje) i tropomiozyna, a w skład grubych głównie miozyna. Grube filamenty są zakotwiczone w błonie komórkowej za pomocą tytyny, która jest największym znanym białkiem. Pisał o niej Piotr Gąsiorowski. Prążki widoczne w mięśniu pod mikroskopem są wynikiem obecności regularnie rozmieszczonych grubych i cienkich filamentów. Ich kompleks zdolny do skurczu nosi nazwę sarkomeru (Ryc. 1).
Ryc. 1. Struktura sarkomeru mięśnia sercowego. Według: Wikipedia, Mohamed Elshennavy. Licencja CC BY 4.0.
Kiedy ma miejsce skurcz mięśnia? Kiedy w sarkomerze pojawią się jony wapnia. Pod wpływem impulsu nerwowego (zwanego bardziej prawidłowo potencjałem czynnościowym) następuje uwolnienie jonów Ca2+ z siateczki sarkoplazmatycznej zwanej też retikulum sarkoplazmatycznym. Jest to obecny w każdym mięśniu prążkowanym system połączonych zbiorników, którego głównym zadaniem jest gromadzenie jonów Ca2+ i rozprowadzanie ich za pomocą kanalików T i cystern brzeżnych. Jony wapnia powodują związanie główek miozyny z aktyną, a wzajemne przesuwanie filamentów jest spowodowane hydrolizą ATP w główkach miozyny (Ryc. 2).
Ryc. 2. Przekrój przez mięsień szkieletowy z widocznymi kanalikami T biegnącymi do wnętrza komórki między dwie cysterny brzeżne, od których odchodzą kanaliki siateczki sarkoplazmatycznej. Sarkolemma to błona komórkowa komórki mięśniowej czyli miocytu. Według: Wikipedia, OpenStax, Licencja CC BY 4.0.
O czego zależy skurcz mięśnia? W przypadku mięśni szkieletowych od naszej woli. W odpowiedzi na „polecenie” wygenerowane we fragmencie czołowego płata kory mózgowej powstaje potencjał czynnościowy, który za pośrednictwem nerwów odśrodkowych trafia do odpowiedniego mięśnia szkieletowego. Przyczyną powstawania potencjałów czynnościowych są zmiany w przepuszczalności błony komórkowej neuronów, spowodowane otwieraniem i zamykaniem się białek przenoszących jony Na+ i K+, czyli kanałów sodowych i potasowych. Ponieważ stężenie jonów Na+ na zewnątrz komórki jest wyższe niż wewnątrz (w przypadku jonów K+ jest odwrotnie), otwarcie kanałów jonowych powoduje chwilową depolaryzację błony komórkowej: różnica potencjałów po obu stronach błony (czyli napięcie) zmienia się z ok. -60 mV na ok. +30 mV. Stały potencjał komórkowy jest utrzymywany przez pompę sodowo-potasową zależną od ATP (NKA). Pisałem o tym w moim wpisie na temat układu nerwowego. Ta zmiana potencjału powoduje uwolnienie jonów Ca2+ z siateczki śródplazmatycznej, a w konsekwencji skurcz mięśnia.
W mięśniu sercowym za skurcze odpowiadają potencjały czynnościowe generowane przez węzeł zatokowo-przedsionkowy. Znajduje się on w ścianie prawego przedsionka serca i jest generatorem wyładowań elektrycznych, które rozpoczynają i kończą każdy cykl akcji serca (możemy badać te cykle za pomocą EKG). Podobnie jak w przypadku mięśnia szkieletowego, powodują one uwolnienie jonów Ca2+ z siateczki sarkoplazmatycznej.
W mięśniu prążkowanym, który się nie kurczy, miozyna nie może związać się z aktyną, ponieważ tropomiozyna skutecznie blokuje dostęp. Ale kiedy z siateczki sarkoplazmatycznej zostaną uwolnione jony Ca2+, wiążą się one do troponiny C zmieniając strukturę kompleksu troponina-tropomiozyna. Aktyna odsłania się i miozyna może się do niej związać. Teraz korzystając z energii zawartej w ATP miozyna zaczyna wędrówkę po filamencie aktynowym, i będzie to robić tak długo, jak będą obecne jony Ca2+. (Ryc. 3).
Ryc. 3. Mechanizm skurczu mięśnia na przykładzie pojedynczego filamentu w sarkomerze. Jony Ca2+ wiążą się do troponiny C, powodując zmianę struktury kompleksu troponina-tropomiozyna. W wyniku tej zmiany struktury główka miozyny wiąże się do aktyny. Zapoczątkowuje to przesuwanie się grubego filamenty po cienkim filamencie, w wyniku czego sarkomer ulega skróceniu. Energia potrzebna do wzajemnego przesuwania się filamentów pochodzi z hydrolizy ATP. Według: Havey C. et al., Cells 2023, 12: 2526. Licencja CC BY 4.0.
Jony wapnia jako klucz do skurczu mięśnia (nie tylko sercowego)
Potencjał czynnościowy przemieszczający się wzdłuż kanalików T powoduje otwarcie kanałów dla sodu i wapnia (NCX). Zewnątrzkomórkowe jony Ca2+ wnikają do komórki, a podwyższenie jego stężenia jest wyczuwane przez receptory rianodynowe (RyR) w błonie siateczki sarkoplazmatycznej. Nazwa pochodzi od alkaloidu z rośliny Ryania speciosa z rodziny wierzbowatych, który mają zdolność do ich blokowania. Receptory RyR są białkami transportującymi wapń: po otwarciu wprowadzają do cytoplazmy jony Ca2+ znajdujące się w siateczce sarkoplazmatycznej. Jony wapnia wiążą się do troponiny i następuje skurcz mięśnia.
Do przerwania skurczu potrzebne jest natomiast obniżenie stężenia jonów Ca2+. Teraz do gry wchodzi pompa wapniowa zależna od ATP (sarco/endoplasmic reticulum ATPase, SERCA), która korzystając z energii ATP przepompowuje jony Ca2+ z powrotem do siateczki sarkoplazmatycznej. Cześć jonów Ca2+ jest też usuwana z komórki przez transporter wymieniający jony Na+ na Ca2+. Spadek stężenia Ca2+ powoduje zmianę struktury troponina-tropomiozyna. Miozyna znów nie może związać się z aktyną, co powoduje relaksację mięśnia. Na tej zasadzie działają zarówno mięśnie szkieletowe, jak mięsień sercowy (chociaż są między nimi pewne różnice). Transportery jonów biorące udział w skurczu mięśnia sercowego pokazano na Ryc. 4. Mięśnie gładkie działają trochę inaczej i zasługują na osobny wpis.
Ryc. 4. Transportery jonów biorące udział w skurczu mięśnia sercowego. Według: Wikipedia, PeaBrainC, Licencja CC BY 4.0.
Kalmodulina i jony wapnia
Tak więc jony wapnia stanowią podstawę regulacji skurczu mięśnia. Jego stężenie jest kontrolowane przez dwa rodzaje białek: te, które transportują jony Ca2+ przez błonę komórkową oraz te, które wiążą te jony wewnątrz komórki. Najważniejszym wewnątrzkomórkowym czujnikiem jonów Ca2+ jest wspomniana kalmodulina, białko składające się ze 148 aminokwasów. Sekwencja aminokwasowa kalmoduliny jest taka sama u wszystkich kręgowców, tak więc można ją uznać za jedno z najbardziej konserwatywnych ewolucyjnie białek. U człowieka, podobnie jak u innych kręgowców, kalmodulina jest kodowana przez trzy geny o nazwach CALM1, CALM2 i CALM3, znajdujące się na chromosomach 14, 2 i 19. Układ intronów (czyli fragmentów genu, które nie kodują białka) i sekwencja aminokwasowa jest taka sama. Różne są natomiast sekwencje promotorów, czyli fragmentów genu odpowiadających za transkrypcję (przepisanie DNA na mRNA). Dzięki tym różnicom poziom transkrypcji (a więc pośrednio ilość białka) jest różny w różnych komórkach. Chociaż sekwencja aminokwasowa tych trzech genów jest taka sama, to sekwencje nukleotydowe wykazują spore różnice. Uważa się na przykład, że dzięki tym różnicom różna jest stabilność (czyli trwałość) mRNA w różnych komórkach. Dzięki temu na przykład w spermatydach, czyli komórkach, z których powstają plemniki, najwięcej jest mRNA dla CALM3, który jest najtrwalszy.
Ze względu na wielopoziomową regulację, poziom mRNA przepisanego z trzech genów może być różny w różnych tkankach. Najwyższa ekspresja genu CALM1 ma miejsce w adipocytach, czyli komórkach tkanki tłuszczowej, genu CALM2 w komórkach płuc, a genu CALM3 w spermatydach. W porównaniu do tych komórek, poziom ekspresji wszystkich trzech genów kalmoduliny w komórkach serca jest stosunkowo niski (ok. 1/3 tego, co wymienionych wyżej genów). Schemat regulacji ekspresji genów kodujących kalmodulinę pokazano na Ryc. 5.
Ryc. 5. Geny kodujące kalmodulinę i regulacja ich ekspresji. Według: Munk M. et al., Cell Calcium 2022, 107:102656. Licencja CC BY 4.0.
Struktura kalmoduliny
Cząsteczka kalmoduliny zawiera cztery miejsca wiążące jony Ca2+. Związanie wszystkich czterech jonów powoduje zmianę jej struktury: łańcuch białkowy w okolicy związanych jonów zmienia położenie, odsłaniając dwa ukryte dotąd fragmenty. Właśnie za pośrednictwem tych fragmentów kalmodulina wiąże się do innych białek, modulując ich działanie. Jakie to białka? Znamy ich dzisiaj ponad 300, mogą to być enzymy, białka szkieletu komórkowego czy pompy jonowe. Wykazano na przykład, że różnice w długości dzioba u tzw. zięb Darwina, czyli w grupie kilkunastu podobnych do siebie gatunków ptaków opisanych przez Karola Darwina na wyspach Galapagos są spowodowane różną ekspresją kalmoduliny. Wyższa ekspresja kalmoduliny powoduje wydłużenie dzioba, a u ptaków z krótszym dziobem kalmoduliny powstaje mniej. Uważa się, że kalmodulina oddziałuje z białkiem BMP4 (4 białko morfogenetyczne kości, bone morphogenetic protein 4) powodując wydłużenie struktur kości dzioba. Kalmodulina może więc być modulatorem rozwoju struktur twarzowo-czaszkowych, a jest to tylko jedna z jej licznych funkcji.
W komórkach mięśni prążkowanych kalmodulina wiąże się do białek transportujących jony Ca2+, blokując ich działanie i biorąc tym samym udział w wygaszaniu sygnału spowodowanego przez jony wapnia. Można więc porównać kalmodulinę do człowieka, który ma obie ręce sprawne, z tym że te ręce pojawiają się dopiero po związaniu jonów Ca2+ (Ryc. 6).
Ryc. 6. Struktura kalmoduliny przed i po związaniu jonów wapnia (niebieskie kółka). Gwiazdkami oznaczono fragmenty, za pomocą których kalmodulina wiąże się do innych białek. Odsłaniają się po związaniu czterech jonów Ca2+. Źródło: Wikipedia, PDB. Licencja CC BY 4.0.
Mutacje w genach kodujących kalmodulinę
Co dzieje się w przypadku mutacji w genach kodujących kalmodulinę? Mogą one wpływać na zdolność tego białka do wiązania jonów Ca2+. Jeżeli kalmodulina może związać tylko trzy jony Ca2+, to jej struktura nie zmieni się w dwóch miejscach, a tylko w jednym. To trochę tak, jakby człowiek miał tylko jedną sprawną rękę. Taka kalmodulina może związać tylko jeden fragment innego białka, tak więc nie może go skutecznie blokować.
Najczęściej spotykane mutacje kalmoduliny przedstawiono na Ryc. 7. Niektóre z nich powodują, że jon Ca2+ nie może zostać związany w danym miejscu, tak jak np. zamiana asparaginy w pozycji 98 na serynę (skrótowa nazwa takiej mutacji to N98S). Wykazano, że taka mutacja może spowodować nagłą śmierć łóżeczkową (sudden infant death, SID). Z kolei zamiana kwasu asparaginowego w pozycji 130 na serynę (D130) może spowodować zespół długiego QT (long QT syndrome, LQTS). Nazwa pochodzi od wydłużenia odstępu QT w elektrokardiogramie. Może to prowadzić do arytmii i migotania komór. Mutacje takie mogą zajść w każdym z trzech genów kodujących kalmodulinę i każda taka mutacja może wywołać poważne skutki kliniczne.
U Kathleen Folbigg i jej dwojga dzieci znaleziono mutację w genie CALM2 polegającą na zmianie glicyny w pozycji 114 na argininę (G114R). Ta glicyna znajduje się dość daleko od miejsca wiązania jonów Ca2+, więc teoretycznie jej zamiana na inny aminokwas nie powinna mieć dużego wpływu na wiązanie. Opisano jednak mutację G114W w genie CALM3, w której glicyna w tej samej pozycji została zastąpiona przez tryptofan. Dzieci, u których znaleziono tę mutację (rodzeństwo), zmarły nagle w wieku 4 i 5 lat. Przyczyną zgonu było migotanie komór i zatrzymanie akcji serca albo nagła śmierć łóżeczkowa. Tak więc glicyna w pozycji 114 ma (pośredni) wpływ na wiązanie jonów Ca2+, chociaż nie bierze w nim bezpośredniego udziału.
Ryc. 7. Struktura kalmoduliny i mutacje powodujące obniżenie jej zdolności do wiązania jonów Ca2+. Po prawej stronie pokazano niektóre mutacje kalmoduliny i przyczyny zgonu dzieci, u których je znaleziono. SID: nagła śmierć łóżeczkowa (sudden infant death), LQTS: zespół długiego QT (long QT syndrome), CA: zatrzymanie akcji serca (cardiac arrest). Podano wiek dziecka w chwili śmierci. Według: Brohus M et al. Europace 2021, 23. 441–450. Licencja CC BY 4.0.
W komórkach mięśni prążkowanych kalmodulina działa jak czujnik podwyższonego stężenia jonów Ca2+. Jeżeli jest ich dużo, to wiąże się do kanałów wapniowych powodując ich zablokowanie. Jeżeli jednak zawiera mutacje takie jak opisane wyżej, to kanał wapniowy nie zostanie zablokowany w sytuacji wysokiego stężenia jonów Ca2+. Taki niezablokowany kanał dalej transportuje jony Ca2+ nawet w sytuacji, gdy skurcz już się skończył i jony Ca2+ są wypompowywane z komórki z powrotem do siateczki sarkoplazmatycznej. W prawidłowej komórce mięśniowej powoduje to znaczne obniżenie ich stężenia, ale w komórce osoby z mutację stężenie jonów Ca2+ nie spada, a więc skrurcz trwa. Pamiętamy, że są trzy geny (czyli sześć alleli) kodujących kalmodulinę, a wzajemny stosunek mRNA dla genów CALM1, CALM2 i CALM3 to 15:25:60. Jeżeli jeden allel genu CALM2 zawiera mutację, to ok. 12,5% cząsteczek kalmoduliny (czyli połowa puli mRNA z genu CALM2) nie działa prawidłowo. I to może wystarczyć, aby zakłócić pracę mięśnia sercowego (Ryc. 8). A co z mięśniami szkieletowymi? Tam też może dojść do podobnej sytuacji, ale skutkiem może być najwyżej lokalny skurcz mięśnia. W jego wyniku raczej nikt raczej nie umrze.
Dlaczego osoby z takimi mutacjami mogą mieć problemy z sercem?
Ryc. 8. Kalmodulina jako modulator kanałów wapniowych. Mutację G114R znaleziono u dzieci Kathleen Folbigg. Zdolność do wiązania tylko trzech (zamiast czterech) jonów Ca2+ powoduje, że kalmodulina z mutacją G114R (kolor czerwony) słabiej wiąże się do białek transportujących wapń: receptora rianodynowego (RyR2) i kanału wapniowego (CaM). Skutkiem jest „przepuszczanie” jonów Ca2+ przez te białka. Według: Brohus M et al., Europace 2021, 23. 441–450. Licencja CC BY 4.0.
Dlaczego Kathleen Folbigg nie miała problemów z sercem?
Uważny czytelnik zapyta: dlaczego dwoje dzieci z mutacją G114R zmarło, podczas gdy ich matka, po której one tę mutacje odziedziczyły, była zdrowa? Dlatego, że mutacje w kalmodulinie nie zawsze dają objawy kliniczne. Przyczyną mogą być mutacje w innych genach, które chronią ich nosicieli przed problemami kardiologicznymi. Przykładami mogą być mutacje w genie KCNQ1, który koduje kanał potasowy bramkowany napięciem, albo w genie NOS1AP, który koduje białko adaptorowe syntazy tlenku azotu. Obecność takich mutacji powoduje, że nawet jeżeli kalmodulina nie działa do końca prawidłowo, to jest to równoważone przez inne czynniki (np. wyższe stężenie tlenku azotu). Takie geny nazywa się genami modyfikującymi (modifier genes). Prawdopodobnie nosicielką jednego z nich jest Kathleen Folbigg.
Literatura dodatkowa
Mechanizm skurczu mięśnia
https://doi.org/10.3390/cells12212526
Rola kalmoduliny w wydłużaniu dzioba u zięb Darwina
https://www.nature.com/articles/nature04843
Rola kalmoduliny w skurczu mięśnia sercowego
https://doi.org/10.1111/febs.12337
Mutacje w genie kalmoduliny związane z arytmią
https://doi.org/10.3390/ijms21041418
Ekspresja kalmoduliny w różnych tkankach
https://doi.org/10.1016/j.ceca.2022.102656
Geny modyfikujące działanie kalmoduliny
