EM poleca (#4): „No Limits – historia największego skandalu farmaceutycznego”

Po trzech rekomendacjach książkowych dzisiaj w cyklu „EM poleca” chciałbym zaproponować  film dokumentalny „NO LIMITS – historia największego skandalu farmaceutycznego” (ang. NO LIMITS – History’s Greatest Drug Scandal 1). Film miał premierę w 2016r.

W latach 50-tych XX w. niemieccy naukowcy w firmie Grunenthal (Grünenthal) opracowali lek pod nazwa talidomid. Był to środek o działaniu przeciwwymiotnym, przeciwbólowym i hipnotycznym. Firma Grunenthal uważała lek za bezpieczny do tego stopnia, że może być używany przez kobiety w ciąży – przepisywano go na poranne nudności i jako środek nasenny. Okazało się, ze talidomid (jego izomer optyczny) ma działanie teratogenne i powoduje wady płodu. Lek został wycofany, ale zanim do tego doszło ofiarami preparatu zostało około 15 tys. ludzkich płodów, z czego 12 tys. zostało donoszonych i urodziło się z poważnymi wadami i deformacjami: zniekształconymi kończynami, uszkodzeniami oczu, uszu i wielu narządów wewnętrznych.

I to nie o samym leku jest ten film, ale o tych dzieciach, które przeżyły, a dzisiaj są dorosłymi ludźmi. Sami siebie nazywają „talidomerami” (ang. thalidomers) i w filmie poznajemy historie życia sześciu osób z USA, Wielkiej Brytanii, Niemiec i Australii. Reżyser John Zaritski przez kilkadziesiąt lat badal sprawę talidomidu, a efektem jest filmowy tryptyk 2, którego ostatnią (i najmocniejszą) częścią jest film „No Limits”.

Ofiary talidomidu walczyły także o to, żeby firma Grunenthal wzięła odpowiedzialność moralną (także finansową) i przyznała się do winy. W 2012r. przedstawiciel firmy „przeprosił” za milczenie przez 50 lat, ale ofiary nie przyjęły tego jako szczerego żalu. Film ujawnia także dokumenty, które rzucają nowe światło na winę firmy Grunenthal i odpowiada na pytanie czy naprawdę nikt nie wiedział, że lek jest zagrożeniem zanim został dopuszczony do sprzedaży.

Polecam ten film także dlatego, ze pokazuje oblicze Big Pharmy 3 – z jednej strony koncerny produkują leki i ratują ludzkie życie, ale stawianie czoła odpowiedzialności za błędy często ukazuje mroczną twarz firm farmaceutycznych.

Film trwa 90 minut (jak standardowy film fabularny) i ładunek emocjonalny ma na prawdę duży – z pewnością nie zanudzi widza. Jest obecny na kilku platformach streamingowych, wiec nie powinno być problemów ze znalezieniem go w sieci i z dostępnością. Jedynym mankamentem może być wersja językowa (angielski), ale możliwe ze są dostępne polskie napisy.

Historia talidomidu jest niezwykle ciekawa i z pewnością na naszym blogu pojawią się jeszcze wpisy o jego historii. Polecany przez mnie film będzie świetnym wstępem.

Gorąco zachęcam do obejrzenia i dzielenia się opiniami.

NO LIMITS – History’s Greatest Drug Scandal

Directed by John Zaritsky

World Festival Premiere May 7, 2016


  1. Postanowiłem nie tłumaczyć zwrotu “No Limits” na język polski. Jest on dobrze zrozumiały, a możliwych wariantów tłumaczenia, a także kontekstów znaczeniowych jest kilka. Pozostawiam czytelnikowi własny wybór polskiego odpowiednika. ↩︎
  2. Tryptyk filmowy o talidomidzie to 3 filmy Johna Zaritskiego: Broken Promises, Extraordinary People, No Limits: The Thalidomide Saga. ↩︎
  3. Big Pharma – potoczne określenie wielkich koncernów farmaceutycznych produkujących leki. ↩︎

Smród nie z tej ziemi. Odcinek 1: Tioaceton

Ze względu na swoje właściwości do pobudzania zmysłów (np. smaku, zapachu) związki chemiczne można uszeregować i stworzyć ranking tych, które najintensywniej pobudzają odpowiednie receptory. W przypadku odorantów (substancji pobudzających zmysł węchu) o najbardziej intensywnym i nieprzyjemnym zapachu sprawa jest bardziej skomplikowana i nie ma jednoznacznych wskazań, który ze związków chemicznych jest najbardziej śmierdzący. I dodam tylko, że mówimy o poziomie fetoru o kilka poziomów wyższym, niż te najbardziej nośne medialnie, jak: szwedzki przysmak Surströmming (sfermentowany śledź), południowo-azjatycki owoc Durian, czy  islandzki specjał Hákarl (sfermentowane mięso rekina).

Dlatego też różne źródła podają czasami wymiennie różne związki jako te najbardziej cuchnące, ale przeważnie czołówka to te same cząsteczki, tylko inaczej przetasowane. Jednym z nich jest tioaceton, uważany przez wielu naukowców jako źródło najgorszego zapachu, jaki można sobie wyobrazić i właśnie o tioacetonie będzie pierwszy odcinek cyklu o wyjątkowo śmierdzących cząsteczkach.

Struktura

Tioaceton (nazwa IUPAC: propan-2-tion) to związek należący do grupy tioketonów, czyli ketonów, które zamiast tlenu (w grupie karbonylowej >C=O) posiadają atom siarki, tworząc grupę tiokarbonylową >C=S. Jego organicznym odpowiednikiem zawierającym tlen, jest aceton – popularny rozpuszczalnik, składnik np. zmywacza do paznokci.

Struktura tioacetonu i acetonu (materiały autora)

Obecność atomu siarki związana jest z ostrymi i cuchnącymi zapachami związków siarkoorganicznych. Przykładem są np. tiole (starsza nazwa merkaptany) występujące w niektórych warzywach jak cebula, szparagi, czy w wydzielinie skunksa.

Właściwości

Tioaceton to lotna, pomarańczowa lub brązowa ciecz o niezwykle silnej i ostrej woni. Zapach opisywany jest jako kombinacja czosnku, zgniłej kapusty i spalonej gumy. Jego obecność w powietrzu w nawet w niewielkim stężeniu powoduje ból głowy,  nudności, wymioty, a nawet utratę przytomności. W przypadku zanieczyszczonej tioacetonem odzieży (nawet kilka kropel), nie ma możliwości jej wyczyszczenia/wyprania, a w przypadku kontaktu z ludzką skórą, zapach może utrzymywać się do kilku miesięcy.  Jeśli chodzi o stabilność, to warto zaznaczyć, ze  tioaceton może być wyizolowany tylko w niskiej temperaturze i powyżej -20 °C polimeryzuje do trimeru – tritioacetonu, który posiada również ostry zapach, chociaż nie tak mocny jak tioaceton.

Struktura tritioacetonu (materiały autora)

Co ciekawe sam tioaceton nie jest toksyczny, ani nie ma właściwości wybuchowych. Jego zapach jest jednak wystarczająco groźny, żeby klasyfikować go do grupy chemikaliów niebezpiecznych i zachować szczególne środki ostrożności przy jakichkolwiek pracach z nim.

Kto go odkrył i po co?

W 1889 r. w niemieckim Freiburgu, dwóch chemików: Eugen Baumann i Emil Fromm prowadziło badania nad polimerami i w trakcie optymalizacji procesu otrzymywania tritioacetonu (wspomnianego powyżej), przypadkowo wyizolowali związek o zapachu trudnym do zniesienia (był to właśnie tioaceton). Tak opisują to w swojej pracy [2]:

„Kiedy świeżo otrzymany produkt reakcji: acetonu, stężonego kwasu solnego i siarkowodoru został poddany destylacji z parą wodną, wydzielający się ostry zapach rozprzestrzenił się szybko na odległość 0.74 km, do odległych części miasta. Mieszkańcy ulic przyległych do laboratorium, zaczęli alarmować że fetor spowodował u niektórych mdłości i omdlenia”

Kolejne próby prac laboratoryjnych z użyciem próżni zredukowały nieco powstający fetor, ale i tak na skutek protestów mieszkańców Freiburga i pozwów, które wysyłali do ratusza, Baumann i Fromm zmuszeni byli przerwać badania nad procesem. Bauman nie zniechęcił się niepowodzeniem i swoja uwagę skierował na syntezę amidów, a stosowana na szeroką skalę w chemii organicznej reakcja Schottena-Baumana, to jeden z jego naukowych sukcesów.

Eugen Baumann (Źródło: Wikipedia /PL/)

W annałach XIX-wiecznej nauki można jeszcze odnaleźć historie prac Juliusa Lewkowitscha nad tioacetonem. Ten wybitny brytyjski chemik (autorytet w przemyśle tłuszczów i olejów) próbował wykorzystać „śmierdzącą” właściwość tego związku i prowadził prace nad wykorzystaniem go jako dodatku do gazu wodnego (syntezowego), aby wykrywać nieszczelności w instalacjach. Okazało się, że tioaceton jest…za dobry. Nawet niewielka jego ilość rozcieńczona znacznie powietrzem powodowała, że zapach był nie do zniesienia. Lewkowitsch również przerwał prace badawcze i zalecał użycie jako nawaniacza znacznie mniej nieprzyjemnej zapachowo akroleiny [3].    

Dalsze prace

Pomimo że właściwości redukujące tioacetonu były zachęcające do użycia go w różnych reakcjach w syntezie chemicznej, przez długi czas nikt nie prowadził badań nad tioacetonem, czemu trudno się zresztą dziwić. Dopiero w latach 60-tych XX w. pojawił się ponownie w literaturze naukowej, kiedy w ośrodku badawczym Esso Research Centre w UK, prowadzono prace nad tioketonami, jako potencjalnymi źródłami nowych polimerów. Dwóch naukowców (V.Burnop i K.Latham) tak opisywało prace z tioacetonem [4]:

„W trakcje prowadzenia eksperymentu napotkaliśmy problemy z wydzielającym się zapachem, który przerósł nasze najśmielsze oczekiwania. W trakcie prowadzenia prac, z jednej z butelek z pozostałością reagentów wyskoczył korek i pomimo szybkiego zamknięcia naczynia, straszny fetor rozszedł się błyskawicznie powodując wymioty i omdlenia u kolegów pracujących w innych budynkach 200 yardów dalej. Dwóch chemików, którzy badali depolimeryzacje niewielkich ilości tritioacetonu, spotkało się (z powodu zapachu) z wrogim nastawieniem innych pracowników, a kelnerka w kantynie pracowniczej publicznie ich upokorzyła, pryskając ich dezodorantem”.

Jak pracować z tioacetonem?

Czy da się w ogóle pracować ze związkiem chemicznym, który ma zapach z piekła rodem? Okazuje się, ze zachowując pewne środki ostrożności, można. Jakie? Oto wytyczne [4]:

„Agresywny zapach wydzielający podczas rozkładu tritioacetonu jest ograniczony lub wyeliminowany poprzez prace w komorze rękawicowej (glovebox), uszczelnionej zasadowym nadmanganianem, a pary tioacetonu mogą być wyeliminowane oparami brunatnego dwutlenku azotu. Wszystkie pozostałości poreakcyjne powinny być poddane termicznej utylizacji w palenisku.”

Komora rękawicowa/glovebox (Źródło: Wikipedia /ENG/)

Trzeba przyznać, ze wymagane środki ostrożności są (na szczęście) dość zniechęcające i raczej ciężko będzie o chętnych do pracy z tioacetonem.

Słowo końcowe

Myślę, ze ten krótki opis jednego z najbardziej śmierdzących związków chemicznych, zainteresował Was czytelnicy na tyle, że będziecie czekać z ciekawością na kolejny odcinek, w którym przedstawię Wam kolejnego fascynującego „śmierdziela”.

Stay tuned…


Bibliografia wykorzystana w tekscie:

[1]. https://www.technology.org/how-and-why/thioacetone-worst-smelling-substance-on-earth/

[2]. E. Baumann and E. Fromm, “Ueber Thioderivate der Ketone,” Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschaft 22 (1889): 2592 – 2599

[3]. Water gas is a combination of carbon monoxide and hydrogen used in gasification. Julius Lewkowitsch, “Odorising Water-Gas,” Chemical News and Journal of Industrial Science 61, no. 1589 (1890): 219

[4]. Chemistry and Industry, 1967, p. 1430

Wirusoterapia jako skuteczne narzędzie walki z nowotworami

Wirusoterapia (wiroterapia) to wschodząca gałąź medycyny, która bada zastosowanie przeprogramowanych wirusów do leczenia różnych chorób, w tym nowotworowych.

Istnieją trzy główne kierunki wykorzystania wirusów w wiroterapii: przeciwnowotworowe wirusy onkolityczne, wektory wirusowe do terapii genowej i immunoterapia wirusowa.

Ale na początek wprowadzenie:

Do przeżycia i rozwoju komórek nowotworowych w guzie niezbędne jest wytworzenie własnych naczyń krwionośnych (angiogeneza) oraz wykształcenie się specyficznego mikrośrodowiska (malicious tumor microenvironment, TME). Tworzenie się nowych naczyń krwionośnych w guzie jest ważnym procesem we wzroście i przerzutowaniu nowotworów, i służy do transportu składników odżywczych oraz usuwania odpadów metabolicznych z komórek nowotworowych.

Komórki złośliwego guza rekrutują prawidłowe komórki, tworząc ostatecznie środowisko składające się z komórek nowotworowych, komórek śródbłonka, komórek odpornościowych, fibroblastów, makrofagów i macierzy zewnątrzkomórkowej otaczającej lub naciekającej tkanki nowotworowe, a także substancji rozpuszczalnych, takich jak cytokiny i czynniki wzrostu wydzielane przez te komórki – to właśnie nazywamy mikrośrodowiskiem nowotworu. Uważa się, że przyczyną niskiej skuteczności terapeutycznej obecnych leków przeciwnowotworowych jest wysoka, lokalna produkcja czynników napędzających unaczynienie guza, a także niedotlenienie (hipoksja). Niedotlenienie to niefizjologiczne obniżenie poziomu tlenu, zjawisko powszechne u większości nowotworów złośliwych. Hipoksja guza prowadzi do zaawansowanego, ale dysfunkcyjnego unaczynienia i nabycia takiego fenotypu komórkowego, które skutkuje wzrostem mobilności komórek i przerzutami.

I teraz …

Wirusy z powodu wywoływania straszliwych chorób były kiedyś kojarzone ze złym diabłem albo złośliwym gnomem, jednak wirusy onkolityczne (oncolytic viruses, OV) można porównać do szlachetnych aniołów, ponieważ mogą ratować życie. Wirusoterapia onkolityczna to nowatorskie podejście do leczenia nowotworów, w którym wirusy selektywnie replikują się w komórkach nowotworowych niszcząc je (onkoliza), a jednocześnie pozostawiając prawidłowe komórki nieuszkodzone. Początkowo, w XX wieku, badania prowadzone nad działaniem onkolitycznym opierały się na ogół na wirusach występujących naturalnie, takich jak wirus Zachodniego Nilu, wirus wścieklizny, żółtej febry, zapalenia wątroby. Później zaczęto modyfikować te wirusy za pomocą inżynierii genetycznej. Zmodyfikowane OV wyposażone w pożądane geny mogą wywierać głębokie działanie przeciwnowotworowe poprzez różne mechanizmy. Początkowo głównym celem rekonstrukcji wirusów była poprawa ich specyficzności wobec komórki docelowej, selektywnej replikacji i onkolizy. Dość szybko doceniono przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną specyficzną dla antygenów wirusowych podczas lizy (rozpadu) guza, co stanowi kolejną zaletę OV jako narzędzia immunoterapii. Dlatego też zaczęto zmieniać strategie w kierunku opracowania wektorów wirusowych w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej w nowotworach i przeciwdziałaniu złośliwemu mikrośrodowisku nowotworu. Możemy zatem wyobrazić sobie wirusy onkolityczne jako „żołnierzy” wyposażonych w różnorodną „wyrafinowaną broń”, aby radzić sobie w różnych sytuacjach, w tym dokonać maksymalnego uszkodzenia nowotworu.

Wyniki terapii z wykorzystaniem wirusów onkolitycznych zależą od trójstronnego wyścigu między replikacją wirusa, aktywacją immunologiczną i wzrostem guza. W przeciwieństwie do konwencjonalnej chemioradioterapii, OV precyzyjnie dokonują lizy komórek nowotworowych poprzez interakcję ze specyficznymi receptorami komórkowymi. Korzyści wynikające z różnych form śmierci komórkowej są różne ze względu na charakterystykę wektorów wirusowych i typ komórek nowotworowych, ale większość z nich może ostatecznie wywołać tzw. immunogenną śmierć komórek poprzez uwolnienie antygenów związanych z nowotworem i inicjacji przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej. Inicjacja odporności, wspomaganie infiltracji doguzowej komórek odpornościowych, odwrócenie immunosupresyjnego działania mikrośrodowiska – wirusy onkolityczne mogą używać wielu „broni”, aby systematycznie i kompleksowo zabijać nowotwory na wiele sposobów.

Nie można jednak ignorować faktu, że wirusy onkolityczne mogą same wywołać odpowiedź przeciwwirusową.  Dlatego wybór i projektowanie wektorów wirusów jest zróżnicowane i elastyczne, biorąc pod uwagę równowagę między wirusami, mikrośrodowiskiem nowotworu i odpornością gospodarza.

Do tej pory naukowcy przeprowadzili szereg przedklinicznych prób i badań klinicznych zarówno z naturalnie występującymi OV (np. reowirusem i wirusem pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej VSV), jak i genetycznie zmodyfikowanymi OV (np. adenowirusem, wirusem krowianki i wirusem opryszczki) z zachęcającymi efektami. Od preparatu H101 stosowanego w leczeniu raka jamy nosowo-gardłowej przyjętego w Chinach w 2005 r. po Delytact stosowany w leczeniu glejaka złośliwego zatwierdzonego w Japonii w 2021 r. Wirusy onkolityczne stopniowo znajdują swoje miejsce jako silna broń przeciwnowotworowa w leczeniu raka. Naukowcy odkryli, że OV idealnie nadają się do strategii skojarzonych, czyli w połączeniu z radio- i chemioterapią. Rozwój metod skojarzonych z zastosowaniem leków przeciwnowotworowych zapewnia synergiczne lub dodatkowe korzyści w walce z nowotworem, dla których wymagana jest walidacja kliniczna w drodze dobrze zaprojektowanych i statystycznie uzasadnionych badań klinicznych.

W wirusoterapii wykorzystuje się najczęściej cztery gatunki wirusów:

Wirus opryszczki pospolitej (herpes simplex virus, HSV) (Ryc. 1), jest wirusem otoczkowym z podwójną nicią DNA (double stranded DNA, dsDNA) jako materiałem genetycznym. Jego duży genom o długości co najmniej 150 kb zapewnia możliwość insercji (wbudowania) stosunkowo dużych, dodatkowych fragmentów DNA. Na powierzchni otoczki znajdują się cztery główne glikoproteiny wirusowe, gB, gD, gH i gL, umożliwiając wirusowi wiązanie z różnymi receptorami komórkowymi. Jako wirus cytolityczny, HSV może infekować wiele typów komórek nowotworowych i szybko się w nich replikować, łatwo rozprzestrzeniając wirusy potomne na kolejne komórki nowotworowe. W celu przeciwdziałania ewentualnej zjadliwości onkolitycznego HSV można zastosować leki, takie jak acyklowir. Mimo że ponad połowa populacji posiada przeciwciała neutralizujące tego wirusa, to nadal może on uniknąć odporności gospodarza za pomocą różnych mechanizmów, co czyni go idealnym wektorem. Obecnie HSV-1 (wirus opryszczki wargowej) jest jednym z najczęściej używanych szczepów OV, takich jak T-VEC, G207 i G47Δ. Wirus HSV-2 (wirus opryszczki genitalnej) również przyciąga coraz większą uwagę i jest obecnie przedmiotem badań. W przypadku onkolitycznego HSV-2 o nazwie OH2 rozpoczęto niedawno badania kliniczne I/II fazy na guzach litych.

Ryc. 1. Wirus opryszczki pospolitej (https://viralzone.expasy.org/5796)

Adenowirusy to bezotoczkowe wirusy o wymiarach 90–100 nm, składające się z genomu dsDNA o wielkości około 26–45 kb otoczonego dwudziestościennym kapsydem z charakterystycznymi wypustkami odpowiedzialnymi za identyfikację receptorów komórkowych (Ryc. 2). Te wypustki adenowirusa można zmodyfikować w celu selektywnego ukierunkowania do konkretnych komórek. Spośród łącznie 57 różnych serotypów, Ad2 i Ad5 są najpowszechniej stosowane jako adenowirusy onkolityczne.

E1A i E1B to kluczowe wczesne geny, które aktywują replikację i transkrypcję kolejnych genów wirusowych Ad2 i Ad5. Jednak mają one właściwości onkogenne, a zatem przed wykorzystaniem adenowirusów jako wektorów muszą być usunięte.  Adenowirusy są jednymi z najczęściej badanych wirusów, ponieważ szybko i wydajnie się replikują, można nimi łatwo manipulować i posiadają silną aktywność lityczną. Ponieważ adenowirus charakteryzuje się rozległym tropizmem tkankowym (może zakażać wiele różnych komórek), należy wzmacniać selektywną replikację adenowirusów tylko w komórkach nowotworowych w celu zapewnienia bezpieczeństwa biologicznego. Pierwszym rekombinowanym adenowirusem był szczep Onyx-015. Atenuację i warunkową replikację Onyx-015 uzyskano poprzez usunięcie genu E1B, blokując tym samym ekspresję onkogennego białka E1B-55kD. Ta delecja uniemożliwia replikację Onyx-015 w prawidłowych komórkach. Onyx-015 był badany w kilku badaniach klinicznych pod kątem różnych nowotworów, w tym glejaka złośliwego (stopień III i IV). Chociaż na podstawie analizy histologicznej w guzach zidentyfikowano naciekające limfocyty i komórki plazmatyczne (produkujące przeciwciała), to nie wykazano jednoznacznej odpowiedzi przeciwnowotworowej. Badania nad lekiem Onyx-015 ostatecznie przerwano po nieudanym badaniu III fazy z udziałem pacjentów z nowotworami głowy i szyi.

Ryc. 2. Adenowirus – uwagę zwracają “wyraziste” receptory powierzchniowe wirusa (https://viralzone.expasy.org/4)

Wirus krowianki to wirus dsDNA o wielkości około 190 kb, należący do rodzaju ortopokswirusów. Cząsteczka wirusa ma wymiar około 270 × 350 nm i wyglądem przypomina cegłę.  Selektywne ukierunkowanie wirusa krowianki jest w dużym stopniu zależne od kinazy tymidynowej, enzymu niezbędny do replikacji wirusa. Wirusowa kinaza zwykle ulega nadekspresji w komórkach złośliwych, ale rzadko w komórkach prawidłowych. W ten sposób naukowcy wygenerowali szczep wirusa krowianki z nokautem* genu kinazy, który replikuje się wyłącznie w komórkach nowotworowych. Do najważniejszych zalet wirusa krowianki należą dobrze poznany genom, szybkie i skuteczne rozprzestrzenianie się wirusa, a także możliwość insercji dodatkowych genów. Najsłynniejszy onkolityczny szczep wirusa krowianki JX-594 można podawać dożylnie, ponieważ opiera się działaniu przeciwciał i dopełniacza.

Ryc. 3. Wirus krowianki (ospy krowiej) (https://viralzone.expasy.org/174?outline=all_by_species)

Reowirus to bezotoczkowy wirus dsRNA, który przedostaje się do komórki gospodarza głównie poprzez endocytozę za pośrednictwem komórkowego receptora JAM-A (Ryc. 4). Okazuje się, że wiele komórek nowotworowych wykazuje nadekspresję tego receptora, np. w raku piersi, niedrobnokomórkowym raku płuc, chłoniaku rozlanym z dużych komórek B i szpiczaku mnogim (to zapewnia selektywność adhezji wirusa do komórek nowotworowych). Innym mechanizmem selektywnego atakowania przez reowirusa komórek nowotworowych jest dominująca mutacja genu/sygnalizacji RAS w nowotworach (odpowiadająca m.in. za unikanie apoptozy). Powoduje ona inaktywację komórkowej kinazy proteinowej R (protein kinase R, PKR), białka przeciwwirusowego, które reguluje translację mRNA oraz reguluje apoptozę i proliferację komórek. W prawidłowych komórkach, PKR może wiązać się z dsRNA reowirusa blokując jego replikację (czyli aktywność wirusa zostaje zahamowana, co jest niekorzystne). A zatem, w komórkach nowotworowych z zablokowaną funkcją PKR nie będzie dochodziło do hamowania replikacji onkolitycznego reowirusa, który będzie powodował ich lizę. Szczep reowirusa Dearing typu 3 (T3D) został wykorzystany do stworzenia komercyjnego wirusa onkolitycznego o nazwie Reolysin. Jest przeznaczony do stosowania dożylnego i prezentuje silne działanie przeciwnowotworowe, nie wykazując żadnej toksyczności ani podrażnienia, które mogłoby ograniczyć dawkę.

Ryc. 4. Reovirus (https://viralzone.expasy.org/105)

Jak wygląda szkolenie wirusów dzikich (występujących naturalnie) na „wykwalifikowanych żołnierzy”?

Po pierwsze – poprawa selektywności wirusów ukierunkowanej na nowotwór

Szkolenie wirusów typu dzikiego na wyspecjalizowane wirusy onkolityczne specyficzne dla nowotworu jest warunkiem wstępnym, który można opisać jako szkolenie cywilów na rekrutów, co może nastąpić albo w procesie infekcji, albo replikacji. Proces szkolenia należy przeprowadzić zgodnie z charakterystyką samych wirusów oraz komórek nowotworowych. Różne gatunki wirusów wykazują odmienne naturalne powinowactwo i preferencje do replikacji w różnych komórkach nowotworowych, podczas gdy genetycznie zmodyfikowane wirusy onkolityczne zaprojektowano z myślą o zwiększonej zdolności celowania w nowotwory. Istnieją dwie główne strategie takich modyfikacji; pierwszym jest zwiększenie powinowactwa i aktywności wiązania wirusów z receptorami na powierzchni nowotworu, u którego ulegają one nadekspresji (jak w przypadku nowotworu piersi). Alternatywnie dokładność celu można zwiększyć poprzez wykorzystanie charakterystyki komórek nowotworowych w celu selektywnej poprawy wydajności replikacji wirusa. Przykłady?

Ze względu na zmienione szlaki sygnalizacyjne w komórkach nowotworowych, ekspresja niektórych receptorów ulega zwiększeniu. Na przykład CD155 ulega nadekspresji na powierzchni wielu komórek nowotworowych, co sprzyja ich inwazji i migracji. Tak się składa, że jest to naturalny receptor dla wirusa polio, dzięki któremu wirus polio może selektywnie infekować komórki nowotworowe. Z kolei białko powierzchniowe gD wirusa opryszczki wiąże się z jego komórkowym mediatorem wejścia (HVEM), którego gęstość na powierzchni komórek jest zwiększona w przypadku czerniaka, raka żołądka i raka wątrobowokomórkowego.

Po drugie – zwiększanie wydajności replikacji wirusów onkolitycznych w cytoplazmie komórek nowotworowych

Poprawa zdolności replikacji wirusów litycznych jest skutecznym podejściem do opracowania ukierunkowanych terapii przeciwwirusowych. Niektóre wirusy mają własne mechanizmy sprzyjające replikacji. Na przykład białko B18R wytwarzane przez niektóre ortopokswirusy blokuje podjednostkę α receptora dla interferonu, hamując odpowiedź przeciwwirusową komórek i promując replikację wirusa. Z kolei mutacja w genie α47 wirusa opryszczki powoduje wczesną ekspresję genu US11, który indukuje replikację wirusa w komórkach nowotworowych – dlatego tak zmodyfikowany onkolityczny wirus opryszczki został zatwierdzony przez Agencję ds. Żywności i Leków (Food and Drug Administration, FDA) jako pierwsza wirusoterapia w leczeniu czerniaka (preparat Talimogene laherparepvec, T-VEC).

Zarówno utrata genów supresorowych nowotworu, jak i rozregulowanie szlaków sygnalizacyjnych w komórkach nowotworowych pomogłyby w selektywnej replikacji wirusa. W przypadku adenowirusów gen kodujący E1B, który może utrzymywać wirusa przy życiu w komórkach, został usunięty w wielu onkolitycznych wirusach, takich jak szczepy adenowirusów H101 i ONYX-015. Jaka jest z tego korzyść? W przypadku infekcji komórek prawidłowych tak zmodyfikowanymi adenowirusami dochodzi do ich apoptozy ze względu na prawidłowe działanie białka p53 (jest to przeciwwirusowa obrona komórki). Z kolei w komórkach nowotworowych białko p53 jest często zmutowane, a zatem komórka nie podlega apoptozie i wirus może litycznie się replikować.

Po trzecie – bezpieczeństwo wirusów onkolitycznych

Wirusy od dawna są postrzegane jako mikroorganizmy chorobotwórcze. Z tego względu kwestionowano bezpieczeństwo wirusów onkolitycznych, zwłaszcza naturalnych (bez modyfikacji), które, jak udowodniono, zabijając komórki nowotworowe niszczą jednocześnie komórki prawidłowe. Dlatego też, należy wprowadzić odpowiednie modyfikacje wirusów onkolitycznych w celu zwiększenia ich bezpieczeństwa dla pacjenta.

A. „Zimna broń” – onkowirusy jako włócznia precyzyjnie wycelowana w komórki nowotworowe

Kiedy wreszcie „wykwalifikowani żołnierze” nabędą umiejętności precyzyjnego namierzenia celu, selektywnej replikacji i będą bezpieczni dla organizmu, są proszeni o zabranie broni do walki z komórkami nowotworowymi. O co chodzi?

Przez ostatnie dziesięciolecia mechanizmy przeciwnowotworowe wirusów onkolitycznych skupiały się głównie na bezpośredniej lizie transformowanych komórek. Jednak tego typu śmierć nie jest korzystna dla organizmu, ponieważ wyzwala reakcje zapalne (czy na pewno? O tym będzie dalej).

Apoptoza, nazywana cichą i spokojną śmiercią komórki, może być wywoływana przez spotkanie tzw. komórkowych „receptorów śmierci” z odpowiednimi ligandami (czyli cząsteczkami, które przyłączając się do tych receptorów indukują apoptozę). Na początkowym etapie infekcji różne wirusy mogą manipulować specyficznymi czynnikami sygnalizacyjnymi w komórkach nowotworowych, aby zahamować apoptozę, zapewniając sobie wystarczający czas i przestrzeń na replikację i reprodukcję. Dlatego, naukowcy „włączają” do specyficznych wobec komórek nowotworowych wirusów białka mające za zadanie połączenie się z “receptorami śmierci” i wywołanie apoptozy tych transformowanych komórek – to jest właśnie ta „zimna broń” (czyli śmierć bez wywołania efektu zapalnego).

Autofagia jest dwulicowym mechanizmem – może utrzymać komórkę przy życiu w warunkach stresowych lub doprowadzić do jej śmierci bez inicjacji procesu zapalnego. Dlatego nie jest łatwym celem w badaniach dotyczących terapii przeciwnowotworowych.

W niektórych eksperymentach próbowano uzbroić wirusy w cząsteczki związane z promocją autofagii, jak na przykład beklinę-1, najczęściej stosowane białko w modyfikacji. Uzbrojenie w beklinę-1 znacząco zwiększało skuteczność terapeutyczną wirusów poprzez indukcję śmierci komórek w hematologicznej białaczce nowotworowopodobnej i szpiczaku. Inne strategie również wskazywały, że może dochodzić do wzmocnienia autofagii komórek nowotworowych jako mechanizmu śmierci. Na przykład szczep onkolitycznego HSV-1 RH2 z niedoborem genu γ34.5 indukował powstawanie autofagosomu i śmierć komórek raka płaskonabłonkowego.

B. „Gorąca broń” – magiczna armata odpornościowa

Naukowcy w coraz większym stopniu skupiają się na immunogenności onkolitycznej wirusów. Dlaczego? Zaraz po lizie komórek nowotworowych uwalniane są potomne wirusy wraz wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami (Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs) i sygnałami DAMPs (Damage-associated molecular patterns – białka, które w zdrowej komórce są zamknięte wewnątrz niej i nie wzbudzają reakcji odpornościowych). PAMPs i DAMPs nakręcają odporność wrodzoną poprzez wiązanie się z receptorami, takimi jak Toll-podobne (Toll-like receptors, TLR) oraz stymulują komórki dendrytyczne i limfocyty NK (natural killer). Te ostatnie wspomagają wirusy w niszczeniu komórek nowotworowych. Natomiast komórki dendrytyczne wychwytują białka wirusowe, aby wywołać odporność adaptacyjną. W efekcie prezentacji antygenów wirusowych przez komórki dendrytyczne limfocytom T, z najbliższych węzłów chłonnych napływają limfocyty T pomocnicze i cytotoksyczne, aby wspomóc walkę z komórkami nowotworowymi. Do tego sama obecność wirusów może stymulować wytwarzanie czynników zapalnych (np. IL-2, IL-12, IL-15, TNF-α) i chemokin (np. CXCL9, CXCL10, CXCL11) przyciągających limfocyty. Jednak problemem jest to, że aktywność naciekających komórek odpornościowych jest hamowana przez komórki immunosupresyjne mikrośrodowiska guza (np. makrofagi związane z nowotworem) i lokalnie produkowane cytokiny przeciwzapalne (np. IL-10, TGF-β). Na szczęście zaproponowano pewne działania pozwalające zmienić „zimny” guz w guz objęty stanem zapalnym, czyli immunologicznie „gorący”. W jaki sposób? Przedstawiono to na poniższej rycinie 5, ale najpierw wyjaśnię, co to jest macierz zewnątrzkomórkowa (extracellular matrix, ECM) „otulająca” guz.

Jako główny składnik mikrośrodowiska guza, macierz zewnątrzkomórkowa zapewnia niszę wzrostową dla większości guzów litych. Tworzy barierę fizyczną i odgrywa kluczową rolę w inicjacji, progresji, przerzutach i lekooporności nowotworu. Wśród nich działanie immunosupresyjne (hamujące odpowiedź immunologiczną) jest głównym mechanizmem progresji nowotworu i niepowodzenia leczenia. Odkładanie się różnych składników wydzielanych przez ECM (np. kolagenu i włókien elastycznych) oraz przebudowa macierzy negatywnie wpływają na naciekanie komórek odpornościowych. Klasycznym przykładem jest macierz zewnątrzkomórkowa gruczolakoraka przewodowego trzustki nazywana „pustynią immunologiczną”. Tradycyjna chemioterapia i ukierunkowana terapia molekularna może utrzymać średni czas przeżycia pacjenta z nieoperacyjnym gruczolakorakiem jedynie przez kilka miesięcy. Naukowcy zdali sobie sprawę, że ECM może służyć jako obiecujący cel terapii przeciwnowotworowych w takich nowotworach, jak rak piersi HER2-dodatni czy glejaki o wysokim stopniu złośliwości, chociaż obecnie nie jest dostępny żaden zatwierdzony lek ukierunkowany na ECM.

Ryc. 5. Przekształcanie guza “zimnego” w guz “gorący” (https://www.nature.com/articles/s41392-023-01407-6#Tab3).

Opis ryciny 5:

Silna immunogenność onkolityczna zmodyfikowanych OV. ① Kiedy OV degradują komórki nowotworowe, jednocześnie uwalniane są wirusy potomne, PAMPs i DAMPs, co wyzwala immunologiczną śmierć komórkową. ② W międzyczasie inicjowana jest odporność wrodzona, gdy komórki dendrytyczne i limfocyty NK współpracują przy usuwaniu komórek guza. ③Komórki dendrytyczne wraz z pochłoniętymi antygenami nowotworowymi szybko migrują do węzłów chłonnych, gdzie aktywowane są limfocyty T, które naciekają ogniska pierwotne i przerzutowe, aby zapewnić odporność nabytą. ④ Ponadto zmodyfikowane OV mają zdolność przełamywania bariery macierzy zewnątrzkomórkowej „otulającej” guz, pobudzając komórki mikrośrodowiska guza do uwalniania czynników zapalnych i chemokin, co odwraca jego immunosupresyjny charakter. ⑤ Dzięki temu wspólnemu wysiłkowi zmodyfikowane OV mogą przekształcić immunologicznie „zimny” guz w „gorący” guz, co przekłada się na ulepszoną i silniejszą odporność przeciwnowotworową.

Pojawienie się leków celowanych wskazuje, że terapia nowotworów wkroczyła w erę medycyny precyzyjnej. Prowadzoną są badania, w których łączy się wirusy onkolityczne z lekami celowanymi. Ze względu na różną biofunkcję leków, dzieli się je głównie na inhibitory angiogenezy, blokujące tworzenie nowych naczyń krwionośnych (np. sorafenib, bewacyzumab), przeciwciała monoklonalne celujące w komórki nowotworowe (np. trastuzumab, cetuximab), inhibitory proteasomów. (np. bortezomib), inhibitory przekazywania sygnału (np. imatynib), inhibitory deacetylazy histonowej (np. worinostat, belinostat), inhibitory naprawy DNA (np. olaparyb). Alternatywnie, leki te można je podzielić na drobnocząsteczkowe lub wielkocząsteczkowe na podstawie ich masy cząsteczkowej. Leki drobnocząsteczkowe mogą przedostawać się do komórek i specyficznie blokować lub konkurować o kluczowe cząsteczki zaangażowane w docelowy szlak sygnalizacyjny, aby mogły odgrywać rolę terapeutyczną. Leki wielkocząsteczkowe zwykle celują w białka błon komórkowych.

​Obecnie do obrotu dopuszczone są tylko cztery produkty zawierające wirusy onkolityczne: Rigvir (SND005), Oncorine (H101), Imlygic (Talimogene laherparepvec, T-VEC) i Delytact (teserpaturev/G47Δ).

Rigvir (SND005) to niezmodyfikowany cytopatyczny ludzki sierocy wirus jelitowy typu 7 (ECHO-7), zatwierdzony do leczenia czerniaka na Łotwie w 2004, co czyni go pierwszym zatwierdzonym lekiem onkolitycznym. W 2006 roku w Chinach zarejestrowano adenowirusa Oncorine (H10113) do leczenia raka płaskonabłonkowego głowy, szyi i przełyku. Jednakże skuteczność leczenia tymi wirusami wynika przede wszystkim z ich wrodzonych właściwości onkolitycznych, a nie ze stymulacji odporności przeciwnowotworowej. Dlatego efekt terapeutyczny stosowania jednego leku jest nadal ograniczony, a strategia leczenia koncentruje się bardziej na terapiach skojarzonych.

W 2015 roku amerykańska FDA zatwierdziła T-VEC, atenuowany wirus opryszczki HSV-2 kodujący czynnik wzrostowy dla granulocytów i makrofagów GM-CSF do miejscowego leczenia nieresekcyjnych zmian skórnych, podskórnych i węzłowych u pacjentów z nawrotowym czerniakiem. Niedawno zatwierdzony OV Delytact (G47Δ) (2021 r, Japonia) wykazał korzyści w zakresie wydłużenia czasu przeżycia pacjentów z resztkowym lub nawrotowym glejakiem wielopostaciowym, przy dobrym profilu bezpieczeństwa.

Do 2022 r. na stronie ClinicalTrials.gov zarejestrowano łącznie 329 badań klinicznych związanych z wirusami onkolitycznymi.

​Badania nad wirusoterapią wiążą się z wyzwaniami, ponieważ zmniejszenie odporności pacjenta onkologicznego osłabia też reakcję na terapię wirusami onkolitycznymi. Co więcej, istnieje pilna potrzeba opracowania modeli nowotworów, które dokładnie odzwierciedlałyby to, co dzieje się zarówno w guzie zakażonym wirusem onkolitycznym, jak i u gospodarza jako całego organizmu.

* Nokaut genowy – obecnie jest to fundamentalna technika inżynierii genetycznej, która pozwala na unieczynnienie wybranego genu badanego organizmu, a następnie na podstawie obserwowanego efektu fenotypowego umożliwia określenie jego funkcji. Technika ta wykorzystywana jest do tworzenia modeli zwierzęcych służących do badania ludzkich chorób i testowania różnych możliwości ich leczenia. Jak dotąd stworzono ponad 500 mysich modeli różnych chorób, w tym schorzeń sercowo-naczyniowych, chorób neurodegeneracyjnych, cukrzycy i wielu typów raka. Za wprowadzenie tej techniki Mario R. Capecchi (USA), sir Martin Evans (Wielka Brytania) i Oliver Smithies (USA) otrzymali w roku 2007 medycznego Nobla.

Źródła:

  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7526376/
  2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2746528/
  3. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0923753421010760
  4. https://www.nature.com/articles/s41571-022-00719-w
  5. https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/21645515.2020.1840887
  6. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3730429/
  7. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3888062/
  8. http://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-terms?cdrid=457964
  9. http://www.amsj.org/archives/3390
  10. https://www.daiichisankyo.com/files/news/pressrelease/pdf/202106/20210611_E_47.pdf