Nobel 2024 i Nobel 2006, czyli mikroRNA i siRNA: podobieństwa i różnice

25/10/202410/11/2024 Marcin Czerwiński2 komentarze

Nagrodę Nobla z fizjologii lub medycyny otrzymali w roku 2024 Victor Ambros z Uniwersytetu Massachusetts i Gary Ruvkun z Uniwersytetu Harvarda za „odkrycie mikro RNA i jego roli w post-transkrypcyjnej regulacji ekspresji genów”. Tu ciekawostka polonijna: ojciec Victora, Longin Bohdan Ambros, urodził się w roku 1923 w Polsce we wsi Dardziszki (powiat Oszmiana, województwo wileńskie, obecnie Białoruś). Osierocony w wieku 8 lat, otrzymał stypendium dla zdolnych dzieci, dzięki któremu mógł podjąć naukę w gimnazjum w Wilnie. Ale uczył się tam tylko rok, bo wybuchła wojna, a on, uciekając przed armią radziecką wpadł w ręce Niemców, którzy zmusili go do pracy w przemyśle zbrojeniowym. Uwolniony przez Amerykanów, pomagał amerykańskim oficerom w sztabie, który znajdował się w rezydencji bogatego Niemca. Była tam duża biblioteka, która umożliwiła mu kontynuowanie edukacji, w tym naukę obcych języków (w sumie znał ich 5). Po wojnie służył w armii amerykańskiej, a obywatelstwo otrzymał w 1953 r. Prowadził farmę w stanie Vermont i miał ośmioro dzieci. Jednym z nich był Victor, pierwszy uczony w rodzinie. Opowiada o tym (a także o swoich odkryciach) w bardzo ciekawym wywiadzie, który przeprowadziła Jane Gitschier dla czasopisma PLOS Genetics.

Nagroda Nobla 2006: interferencja RNA

Nagroda Nobla dla Ambrosa i Ruvkuna nie jest jednak pierwszą nagrodą za odkrycie regulacji genów przez małe cząsteczki RNA. W roku 2006 Andrew Fire z Uniwersytetu Stanforda i Craig Mello z Uniwersytetu Massachusetts otrzymali Nagrodę Nobla za „odkrycie interferencji RNA – wyciszania genów przez dwuniciowe RNA”. Mamy więc dwie nagrody Nobla za odkrycie podobnych zjawisk. Ale czym jest regulacja ekspresji genów i dlaczego ten proces jest tak ważny?

Regulacja ekspresji genów

Komórki różnych tkanek zawierają ten sam zestaw genów, ale tylko niektóre z tych genów ulegają ekspresji (czyli kodowane przez nie białko zostaje wyprodukowane) w danym miejscu i czasie. Jest to sprawa wielkiej wagi, bo każdy rodzaj komórki wymaga obecności ściśle określonych białek kodowanych przez ściśle określone geny, musi więc być precyzyjnie regulowany. Proces ten nazywamy regulacją ekspresji genów (Ryc. 1). Pierwszym jej etapem jest związanie enzymu syntezującego RNA, czyli polimerazy RNA, do elementów regulatorowych genu. Może to mieć miejsce tylko w obecności białek zwanych czynnikami transkrypcyjnymi, które swoiście rozpoznają sekwencje DNA w elementach regulatorowych genu. Współdziałanie tych białek i polimerazy RNA sprawiają, że powstaje mRNA (które przeważnie później zostanie „przepisane” na białko). Można zapytać: czy powstanie mRNA równa się powstaniu białka? Niekoniecznie. Mechanizmy takiej regulacji ekspresji genów zostały opisane przez laureatów Nagród Nobla z 2006 i 2024 r.

Ryc. 1. Przepływ informacji genetycznej od DNA do białka. Według: Nobel Foundation, Licencja CC BY 4.0.

Co to jest mikroRNA?

Victor Ambros i Gary Ruvkun badali wpływ mutacji genów u niepasożytniczego nicienia Caenorhabditis elegans, który pomimo małych rozmiarów (1 mm długości) ma podobną liczbę genów jak człowiek (ok. 20 000) oraz podobnie zróżnicowane typy komórek. Stanowi więc doskonały organizm modelowy w badaniach nad ekspresją genów oraz ich regulacji. W latach 80 ubiegłego wieku obaj badacze zajmowali się mutantami C. elegans o nazwach lin-4 i lin-14, które wykazywały pewne defekty budowy ciała. Odkryli, że powoduje je mutacja w genie lin-14. Gen ten koduje czynnik transkrypcyjny odpowiedzialny za rozluźnianie chromatyny, czyli sposobu, w jaki DNA jest zorganizowane w jądrze komórkowym. Produkcja białka lin-4 była jednak w tajemniczy sposób regulowana przez produkt genu lin-14, który nie kodował żadnego białka. Jego sekwencja odpowiadała jedynie małemu fragmentowi RNA. Okazało się, że ten mały fragment RNA ma sekwencję komplementarną do mRNA kodującego białko lin-4 i jest w stanie zahamować produkcję tego białka (Ryc. 2). Opisali to zjawisko w artykułach opublikowanych w tym samym numerze prestiżowego czasopisma Cell w 1993 r. Było to coś całkowicie nowego w naukach przyrodniczych i może właśnie dlatego publikacje te nie zwróciły początkowo niczyjej uwagi (czyli, jak się pisze teraz w recenzjach doktoratów i habilitacji, ich cytowalność była słaba).

Ryc. 2. Role genów lin-4 (matryca dla mikroRNA) i lin-149 (koduje białko) w rozwoju C. elegans. Gen lin-14 koduje białko związane z organizacją chromatyny. Gen lin-4 koduje małą cząsteczkę RNA, która jest częściowo komplementarna do mRNA kodującego białko lin-14. Według: Nobel Foundation. Licencja CC BY 4.0.

Wszystko zmieniło się w r. 2000, kiedy zespół Ruvkuna opisał inną małą cząsteczkę RNA o nazwie let-7, która również hamuje ekspresję genów kodujących białka związane z modelowaniem chromatyny. Co ważne, homologi (czyli odpowiedniki) tego genu znaleziono u wszystkich przebadanych gatunków, w tym u człowieka (Ryc. 3). Znaczyło to, że ten rodzaj regulacji ekspresji genów nie jest wyłączną cechą C. elegans, ale występuje u większości organizmów. Ten artykuł spotkał się z wielkim zainteresowaniem. W krótkim czasie odkryto kilkaset rodzajów cząsteczek RNA o takich samych właściwościach, które nazwano mikroRNA. Okazało się, że geny, w których sekwencje są zapisane, są obecne w genomach większości znanych organizmów. Jedną z niewielu grup, u której ich nie ma, są żebropławy (Ctenophora). Ostatnio było o nich głośno z powodu znalezienia u nich jedynego w swoim rodzaju układu nerwowego.

Ryc. 3. Geny lin-4 i lin-7 w różnych organizmach. Według: Nobel Foundation. Licencja CC BY 4.0.

Interferencja RNA

Dobrze, a co z interferencją RNA, opisaną u C. elegans przez Andrew Fire and Craiga Mello w 1989 r., za którą dostali Nagrodę Nobla w 2006 r.? Przedmiotem ich badań był gen unc-22 kodujący białko wpływające na strukturę mięśni tych nicieni, a tym samym na ich zdolność do poruszania się. Wstrzyknięcie krótkich jednoniciowych fragmentów RNA komplementarnych do sekwencji tego genu do gonad nicieni nie miało wpływu na ich zdolność do poruszania się, niezależnie od tego, czy fragmenty te były komplementarne do mRNA (tzw. antysenensowne RNA), czy też miały taką samą sekwencję (sensowne RNA). Jeżeli jednak wstrzyknięto krótki fragment dwuniciowego RNA, nicienie traciły zdolność do sprawnego poruszania, co objawiało się skurczami (Ryc. 4). Miały one miejsce także u potomstwa nicieni, którym wstrzyknięto cząsteczki RNA. Autorzy sugerowali, że taki dwuniciowy fragment RNA może zahamować ekspresję genu, a mechanizm tego zjawiska może być zbliżony do degradacji dwuniciowych fragmentów RNA pochodzących z wirusów. Nazwali go interferencją RNA, a małe cząsteczki RNA, które ten mechanizm uruchamiają – siRNA (short interfering RNA, czyli krótkie interferujące RNA).

Ryc. 4. Jak dwuniciowe DNA wpływa na ekspresję genu u C. elegans (eksperyment Fire and Mello). Według: Nobel Foundation. Licencja CC BY 4.0.

siRNA i mikroRNA

Jak siRNA ma się do mikroRNA? Są to w zasadzie dwa oblicza tego samego zjawiska, czyli regulacji ekspresji genów na poziomie mRNA. Prekursorami obu cząsteczek są dwuniciowe cząsteczki RNA, przy czym siRNA powstaje z dłuższych cząsteczek. siRNA pochodzi raczej spoza komórki (przeważnie z wirusów RNA, ale może też być produktem transpozonu, czyli genu który może przemieszczać się na inną pozycję w genomie tej samej komórki). Sekwencja mikroRNA jest zapisana w genomie komórkowym. Wstępna obróbka tych cząsteczek przebiega jednak w podobny sposób. MikroRNA powstaje w jądrze komórkowym, gdzie jest wstępnie degradowane przez enzym o nazwie Drosha (jego partnerem jest Pasha). Po eksporcie z jądra do cytoplazmy przez białko o nazwie eksportyna 5, mikroRNA ulega degradacji przez enzym o nazwie Dicer (po angielsku: kostkarka do lodu) na krótkie dwuniciowe fragmenty. Podobny mechanizm zachodzi w przypadku siRNA, z tym że ono pojawia się od razu w cytoplazmie (np. w wyniku wstrzyknięcia). Następnie kompleks białek o nazwie RISC (RNA-induced silencing complex, kompleks wyciszający indukowany przez RNA) we współpracy z białkiem Argonaut usuwa jedną z nici RNA. Pozostaje tylko nić komplementarna do docelowego mRNA. W przypadku siRNA komplementarność jest 100-procentowa i takie fragmenty mRNA są degradowane przez nukleazy swoiste wobec dwuniciowego RNA. Jeżeli komplementarność nie jest jednak stuprocentowa (a przeważnie taką właściwość mają cząsteczki mikroRNA), to taki dwuniciowy fragment RNA hamuje translację uniemożliwiając rybosomowi przesuwanie się po nici mRNA (Ryc. 5).

Ryc. 5. Mechanizm działania siRNA i mikroRNA. RISC: kompleks wyciszający indukowany przez RNA, AGO: białko Argonaut. Według: Lam J.K.W. et al., Mol. Ther. Nucl. Acid 2015, 4:e252. Licencja CC BY 4.0.

Do czego służą siRNA i mikroRNA w komórce? siRNA to głównie obrona przed obcym RNA, przede wszystkim wirusowym. MikroRNA to przede wszystkim regulator ekspresji genów. Mechanizm ich działania jest jednak podobny i opiera się na wykorzystaniu tych samych enzymów.

Podobieństwa i różnice między mikroRNA i siRNA pokazałem w poniższej tabeli.

Tak więc różnica między mikroRNA i siRNA jest niewielka i w zasadzie dotyczy tylko podobieństwa sekwencji między małym RNA i fragmentem mRNA. Zarówno mikroRNA, jak i siRNA to małe cząsteczki RNA wykazujące podobną (mikroRNA) lub identyczną (siRNA) sekwencję wobec sekwencji mRNA (a więc i genów), których ekspresję mają hamować. Dlatego siRNA może hamować ekspresję tylko jednego genu, a mikroRNA wielu (nawet 100). Oba rodzaje cząsteczek mogą wywoływać zjawisko interferencji RNA. Można więc powiedzieć, że Fire i Mello odkryli zjawisko interferencji RNA, a Ambros i Ravkun (na 6 lat przed nimi) cząsteczki RNA, które mogą to zjawisko wywoływać. Co ciekawe, Fire i Mello w swojej publikacji z 1998 r. nie powołali się na prace Ambrosa i Ravkuna, mimo że pracowali na tym samym organizmie (C. elegans).

Czy interferencja RNA może być podstawą terapii?

Odkrycie zjawiska interferencji RNA wzbudziło wielkie nadzieje na otrzymanie nowych leków opartych na tym mechanizmie, a firmy farmaceutyczne zainwestowały duże środki w badania nad siRNA. Okazało się jednak, że nie jest to wcale takie proste. Pierwszym i zasadniczym problemem jest dostarczenie RNA do komórki. Cząsteczki RNA są nietrwałe, ponieważ łatwo ulegają degradacje przez wszechobecne RNAzy, czyli enzymy degradujące RNA. Nie można zatem po prostu zrobić zastrzyku z RNA: potrzebny jest specjalny system dostarczający jego cząsteczki do komórek. Ponadto, obce RNA może też spowodować uruchomienie odpowiedzi odpornościowej, podobnie jak to ma miejsce w przypadku infekcji wirusowych (a także szczepionek zawierających mRNA, jak np. szczepionka na COVID-19). Zauważono też, że większość RNA dostarczonego do organizmu trafia do wątroby, tak więc terapia chorób wątroby za pomocą siRNA wydaje się mieć największe szanse powodzenia. Istnieje już kilka leków opartych o technologię siRNA, które wykazują dużą skuteczność w terapiach rzadkich chorób genetycznych. Jedną z nich jest rodzinna polineuropatia amyloidowa, znana też jako choroba Corino de Andrade. Jej przyczyną są mutacje w genie TTR, który koduje transtyretinę. Białko to transportuje hormony tyroksynę (T4) z tarczycy (gdzie powstaje) do wątroby. Mutacja powoduje, że białko to tworzy agregaty, które gromadzą się w neuronach powodując nieodwracalne uszkodzenie tkanki nerwowej. Objawy (bóle, mrowienie, drętwienie kończyn, a z czasem utrata koordynacji ruchów i paraliż) pojawiają się w wieku 20-40 lat, a pacjenci umierają średnio 10 lat później. Zatwierdzony w 2018 r. lek o nazwie patisiran (Onpattro) to siRNA komplementarne wobec genu TTR, podawane dożylnie w postaci nanocząstek lipidowych. Ok. 1000 ludzi na całym świecie dotkniętych tą chorobą poddano leczeniu i u większości objawy ustąpiły.

Innym lekiem opartym o technologię siRNA jest Givlaari (givosiran), który w 2019 r. został zatwierdzony w leczeniu porfirii. Choroba ta polega na gromadzeniu się porfiryny, cyklicznej cząsteczki będącej prekursorem hemu. Lek ten obniża ekspresję genu ALAS1, który koduje syntazę kwasu δ-aminolewulinowego. Nadmierna produkcja tego enzymu jest przyczyną choroby.

Ciekawym zastosowaniem technologii siRNA jest Fitusiran, obecnie w trzeciej fazie badań klinicznych. Jest to małe dwuniciowe RNA o sekwencji komplementarnej do genu SERPINC1, który koduje antytrombinę. Białko to jest inhibitorem krzepnięcia, a więc obniżenie jego poziomu polepsza parametry krzepnięcia u osób chorych na hemofilię. Jest więc nadzieja, że chorzy na tę chorobę nie będą musieli wstrzykiwać sobie czynników krzepnięcia, tak jak ma to miejsce teraz.

Jest jeszcze kilka innych zastosowań technologii siRNA w medycynie, ale na razie liczba ta nie jest imponująca. Dlaczego? O ile samo hamowanie genów za pomocą siRNA jest dość proste, to dostarczanie cząsteczek siRNA do organizmu łączy się z wieloma problemami (które wymieniłem). Ale skoro szczepionki mRNA przeciw wirusowi COVID-19 okazały się takim sukcesem, to może i technologia siRNA się rozwinie?

mikroRNA w terapii celowanej

Uważa się, że ludzki genom może zawierać nawet 2600 genów kodujących mikroRNA, z czego dobrze poznanych jest ok. 500. Uważa się, że mogą one kontrolować ekspresję nawet 60% genów, tak więc mutacja w jednym genie kodującym mikroRNA może spowodować, że ekspresja wielu genów ulegnie zmianie. Związki miedzy mikroRNA i kontrolowanymi przez nie genami nie są jednak jeszcze dobrze poznane. Wiadomo np., że mutacje w genie kodującym mikroRNA-96 (miR-96) mogą być przyczyną dziedzicznej głuchoty, a mutacje w miR-184 – dziedzicznej zaćmy. Teoretycznie więc „poprawa” działania tych mikroRNA mogłaby służyć jako terapia w leczeniu tych chorób. Badania w tym kierunku są prowadzone, ale największe nadzieje wiążą się z leczeniem chorób nowotworowych, bo w licznych nowotworach mikroRNA nie działa we właściwy sposób. Takie cząsteczki mikroRNA, których powstaje zbyt dużo lub zbyt mało, mogą wpływać na ekspresję genów kodujących białka związane z nowotworzeniem. Nazywane onkomirami (oncomirs), mogą tę ekspresję hamować lub przyspieszać. Schemat ich działania pokazałem na Ryc. 6, a swoistość poszczególnych mikroRNA na Ryc. 7.

Ryc. 6. Jak mikroRNA może wpływać na cechy nowotworów. Według: Menon A. et al., Int. J. Mol. Sci. 2022, 23:11502. Licencja CC BY 4.0.

Ryc. 7. Wpływ niektórych mikroRNA na powstawanie nowotworów. Według: Menon A. et al., Int. J. Mol. Sci. 2022, 23:11502. Licencja CC BY 4.0.

Można sobie wyobrazić, że wpływając na syntezę mikroRNA będzie można zahamować rozwój nowotworu, a nawet zupełnie go unieszkodliwić. Niestety, mamy tu ten problem, co w przypadku siRNA. Obecnie ma miejsce wiele prób klinicznych leków opartych o mikroRNA, ale żadna z nich jak dotąd nie zakończyła się sukcesem. Przyczyny są te same: problemy z dostarczeniem RNA do komórek, reakcje obronne organizmu, albo brak wystarczającego zahamowania ekspresji danego genu.

Podsumowanie

Laureaci Nagród Nobla z lat 2006 i 2024 odkryli w zasadzie to samo zjawisko: krótkie cząsteczki RNA wpływają na aktywność mRNA, hamując tym samym ekspresję genu. Jest jeden warunek: sekwencja takiej krótkiej cząsteczki RNA musi być taka sama, jak sekwencja mRNA (albo bardzo podobna). Tworzy się wtedy dwuniciowe RNA, które ulega degradacji przez specjalne enzymy o których pisałem.

A skąd biorą się te krótkie cząsteczki RNA? Mogą być zapisane w genomie i działać jako „regulatory” ekspresji genów. Nazywamy się wtedy mikroRNA. A mogą też pochodzić spoza komórki, na przykład z wirusów, lub powstawać w wyniku transkrypcji transpozonów. W obu przypadkach, jeżeli sekwencje „krótkiego” i „długiego” RNA (czyli mRNA) są wystarczająco podobne, to powstanie dwuniciowe RNA. I takie RNA ulegnie degradacji.

Praktyczne wykorzystanie tych odkryć w leczeniu chorób jest całkiem możliwe, ale na razie tworzy wiele problemów technicznych. Miejmy nadzieję, że uda się je pokonać.

Literatura dodatkowa

Wywiad z Victorem Ambrosem

https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1000853

Odkrycie micro RNA

https://doi.org/10.1016/0092-8674(93)90529-Y

https://doi.org/10.1016/0092-8674(93)90530-4

Odkrycie siRNA

https://www.nature.com/articles/35888

Podobieństwa i różnice między siRNA i mikroRNA

https://doi.org/10.1038/mtna.2015.23

Rola mikroRNA w rozwoju nowotworów

https://www.termedia.pl/Role-of-microRNA-in-pathogenesis-diagnostics-and-therapy-of-cancer,3,6895,1,1.html

Witamina B12: kłopotliwa spuścizna ewolucji (1)

28/04/202406/05/2024 Marcin Czerwiński5 komentarzy

Ten cykl czterech wpisów podzieliłem na cztery tematy:

Czym jest witamina B₁₂?

Roztwór witaminy B₁₂. Fot. Marcin Czerwiński

Witamina B₁₂, znana też jako kobalamina, wyróżnia się wśród innych witamin pięknym czerwonym kolorem. Podobnie jak inne witaminy, musi być dostarczana do organizmu z pokarmem, ale różni się od nich złozonym systemem wchłaniania i transportu w naszym organizmie. Żeby ją przyswoić, potrzebujemy 13 różnych białek. Ponadto, o ile inne witaminy są syntetyzowane przez większość organizmów (np. witaminy C nie produkują tylko ludzie i małpy oraz niektóre nietoperze i gryzonie), to B₁₂powstaje wyłącznie w mikroorganizmach, a i to nie wszystkich. Dlaczego ewolucja stworzyła taki osobliwy system?

O istnieniu witaminy B₁₂ wiedziano od lat 20. ubiegłego wieku, kiedy George Minot i William H. Murphy (Harvard University) wykazali, że można wyleczyć poważną chorobę krwi zwaną anemią złośliwą za pomocą ekstraktów z wątroby. Zagadkową substancję nazwali „czynnikiem zewnętrznym”, bo do jej działania potrzebne było jeszcze coś, co wydzielają komórki żołądka, a co nazwali „czynnikiem wewnętrznym”. Za odkrycie leczenia anemii za pomocą wyciągów z wątroby badacze ci otrzymali Nagrodę Nobla z fizjologii/medycyny w 1934 r. Trzecim laureatem był George Whipple (Uniwersity of Rochester), specjalista od fizjologii wątroby.

„Czynnik zewnętrzny” pozostawał zagadką przez następne 20 lat, kiedy badaczom z firm Merck w USA i Glaxo w Wielkiej Brytanii udało się wyizolować z wątroby czerwoną krystaliczną substancję, która była skuteczna w leczeniu anemii złośliwej. Nazwano ją witaminą B₁₂, a strukturę wyjaśniła Dorothy Crowfoot Hodgkin (Cambridge University) pod koniec lat 50. ubiegłego wieku. W 1964 r. otrzymała Nagrodę Nobla z chemii „za wyjaśnienie struktury ważnych związków biochemicznych” (Ryc. 1)

Ryc. 1. Laureaci nagrody Nobla za badania nad witaminą B₁₂. Źródło; Wikipedia, domena publiczna.

Struktura witaminy B₁₂

Witamina B₁₂ jest syntetyzowana tylko przez mikroorganizmy (bakterie i archeony), a jej struktura jest najbardziej złożona wśród wszystkich witamin. W centrum cząsteczki znajduje się jon kobaltu na III stopniu utlenienia (Co³⁺). Jest on związany koordynacyjnie przez cztery atomu azotu wchodzące w skład wielopierścieniowego układu nazywanego układem korynowym. Ten rodzaj pierścienia znamy np. z hemoglobiny, białka przenoszącego tlen w krwinkach. Cząsteczką wiążącą tlen jest pierścieniowy związek o nazwie hem, i to właśnie on wiąże tlen w płucach i oddaje go w tkankach (a także nadaje krwinkom czerwoną barwę). Inną podobną cząsteczką jest chlorofil, a jego rola polega na wychwytywaniu kwantów światła i generowaniu z nich energii chemicznej w postaci adenozynotrifosforanu (ATP). W centralnej części pierścieni tych związków jest przeważnie jon metalu: w hemie jest to żelazo, a w chlorofilu magnez. „Szkielet” pierścieni wchodzących w skład kobalaminy, hemu i chlorofilu nosi nazwę uroporfirynogenu III (Ryc. 2).

W kobalaminie pierścień jest związany z cząsteczką α-ryboazolu (który jest pochodną rybonukleotydu) za pomocą łącznika o nazwie aminopropanol. Obecny w witaminie B₁₂ jon kobaltu może dodatkowo związać grupę metylową, cyjanową (bardziej prawidłowo: nitrylową), hydroksylową albo 5’-deoksyadanozynową. Najbardziej stabilna jest cyjanokobalamina, i to ona właśnie występuje w preparatach handlowych (np. w suplementach diety). Tę cechę można wykorzystać w terapii zatruć cyjankami, ponieważ kobalamina ma wysokie powinowactwo wobec grupy cyjanowej i może służyć jako odtrutka.

O zatruciach cyjankami pisał Lucas Bergowsky

W organizmie cyjanokobalamina ulega przekształceniu do adenozylokolabaminy, która jest aktywną biologicznie formą witaminy B₁₂.

Ryc. 2.

A. Struktura kobalaminy i jej cztery formy. Grupą R może być: -CN (cyjanokobalamina), -OH (hydroksykobalamina), -CH₃ (metylokobalamina), -Ado (adenozylokobalamina). Pokazano też wzór adenozyny. Źródło: Wikipedia, Alsosaid 1987. Licencja CC BY 4.0.

B. Struktury uroporfirynogenu, hemu i chlorofilu. Źródło: Wikipedia, domena publiczna.

Witamina B₁₂ ma więc skomplikowaną budowę, jest produkowana wyłącznie przez mikroorganizmy, ale jednocześnie jej brak grozi nam poważnymi chorobami, takimi jak anemia złośliwa czy zaburzenia neurologiczne. Dlaczego tak się dzieje? O tym w następnym odcinku.

Kazimierz Funk, zapomniany odkrywca witamin

22/08/2023 Marcin CzerwińskiLeave a comment

Kazimierz Funk. Źródło: Wikipedia, domena publiczna.

Witaminy znają wszyscy, ale mało kto wie, że słowo „witamina” zostało stworzone przez urodzonego w Warszawie Kazimierza Funka. On też jako pierwszy wykazał, że otręby ryżowe zawierają substancję, która zapobiega chorobie beri-beri, i zaproponował, że jest to witamina. Czterokrotnie nominowano go za to do Nagrody Nobla. Wśród Polaków, którzy na nią zasługiwali, ale nigdy jej nie dostali, on był chyba najbliżej. Tu kilka słów o nim.

Kazimierz Funk urodził się 23.02.1884 w Warszawie w rodzinie spolonizowanych Żydów. Studiował biologię na Uniwersytecie w Genewie i chemię na uniwersytecie w Bernie, gdzie w 1904 r. uzyskał stopień doktora. Później pracował w Instytucie Pasteura w Paryżu, na Uniwersytecie w Berlinie, w szpitalu w Wiesbaden, a w 1910 r. przeprowadził się do Londynu, gdzie podjął pracę w Instytucie Medycyny Zapobiegawczej Listera w Londynie. I tam zetknął się z problemem beri-beri.

Beri-beri i witaminy

W tym czasie powszechne były choroby spowodowane niedoborami pokarmowymi, takie jak szkorbut, beri-beri, krzywica czy pelagra. Szkorbutowi umiano już zapobiegać za pomocą soku z cytryn i limonek (pisała o tym Agnieszka Szuster-Ciesielska).

Ale beri-beri stanowiła ogromny problem, zwłaszcza w rejonach, gdzie podstawą żywienia był ryż. W chorobie tej ma miejsce osłabienie mięśni, drżenie rąk i nóg, chorobowe zmiany na skórze i powiększenie serca. Nazwa choroby pochodzi od słowa „owca” w języku hindi i odnosi się do niepewnego, chwiejnego sposobu chodzenia, który można zaobserwować u owiec. Uważano, że przyczyną tej choroby są bakterie, których jednak w żaden sposób nie udało się wyizolować. Pewną wskazówkę stanowiły badania Gerrita Gijnsa i Chistiaana Eijkmana z Uniwersytetu w Utrechcie. W 1906 r. zauważyli oni, że beri-beri pojawia się u osób, które żywią się głównie łuskanym (czyli pozbawionym otrąb) ryżem: pełnoziarnisty ryż nie dawał tych objawów. W otrębach ryżowych było więc coś, co przeciwdziałało powstaniu objawów beri-beri, ale Gijns i Eijkman początkowo byli przekonani, że ryż zawiera nieszkodliwy związek przerabiany przez bakterie jelitowe w toksynę wchłanianą do krwiobiegu i uszkadzającą układ nerwowy. Antidotum na tę toksynę miałoby się znajdować w otrębach. Poszukiwanie tej substancji nie przyniosło jednak rezultatów (Ryc. 1).

Ryc. 1. Pacjent z objawami beri-beri z południowo-wschodniej Azji oraz pierwsza strona książki Funka. Źródło: Casimir Funk, Die Vitamine, ihre Bedeutung für die Physiologie und Pathologie: mit besonderer Berücksichtigung der Avitaminosen: Beriberi, Skorbut, Pellagra, Rachitis. Verlag von J. F. Bergmann, Wiesbaden 1914. Domena publiczna.

W 1910 r. do Instytutu Medycyny Zapobiegawczej przyjechał William Braddon, brytyjski lekarz wojskowy zajmujący się chorobami tropikalnymi. Zasugerował on, że przyczyną beri-beri jest obecność w otrębach ryżowych jakiegoś aminokwasu, i to jego niedobór powoduje tę chorobę. Kazimierz Funk podjął się zadania wyizolowania tego związku i zbadania jego aktywności. W tym celu stworzył model badawczy, w którym gołębie karmione wyłącznie łuskanym ryżem zaczynały chorować na polineuropatię, która była ptasim odpowiednikiem beri-beri. Grupę kontrolną stanowiły gołębie karmione pełnoziarnistym ryżem. Pracując w pojedynkę, wyizolował z kilkuset kilogramów otrąb ryżowych kilka gramów substancji, która w bardzo małym stężeniu przywracała zdrowie ptakom z doświadczalną polineuropatią. Stwierdził, że nie jest to aminokwas (mimo że zawiera grupę aminową), składa się z węgla, wodoru, tlenu i azotu oraz ma charakter zasadowy. Publikacja ukazała się w 1911 r. w Journal of Physiology.

Opierając się na znaczeniu tego związku dla życia, zaproponował dla niej nazwę „witamina” (od vita– życie i amine – związek zawierający grupę aminową). Dyrekcja Instytutu Listera była jednak sceptyczna co tego terminu i nie wyrażała zgody na jego używanie w publikacjach afiliowanych przy Instytucie. I tu pojawił się Ludwik Rajchman (kuzyn Ludwika Hirszfelda), kierownik Wydziału Bakteriologicznego w Królewskim Instytucie Zdrowia Publicznego w Londynie. Namówił on Funka na opublikowanie w Journal of State Medicine (którego był jednym z wydawców), co nie wymagało akceptacji Instytutu Listera. Praca ukazała się po angielsku w 1912 r. i po raz pierwszy jest w niej mowa o witaminach (jeszcze w wersji „vitamine” jako substancjach zapobiegających chorobom takim jak szkorbut, beri-beri, pelagra czy krzywica, która w tym czasie występowała u 50% dzieci z miejskich terenów Wielkiej Brytanii. Autor podkreślił w niej rolę zbilansowanej diety w profilaktyce tych chorób. Rozszerzona wersja tej publikacji ukazała się w 1914 r. po niemiecku jako książka „Witamina. Jej znaczenie w fizjologii i patologii, ze szczególnym uwzględnieniem awitaminoz (beri-beri, szkorbut, pelagra, krzywica”. Książka zyskała dużą popularność i była tłumaczona na wiele języków.

Witaminy B₁ i B₃

Co wyizolował Kazimierz Funk z otrąb ryżowych? Nie była to czysta witamina B₁, bo w tych czasach było to jeszcze niemożliwe. Prawdopodobnie była to mieszanina niacyny, czyli kwasu nikotynowego i jego amidu (witamina B₃) z tiaminą (witamina B₁). Oba te związki pełnią ważną rolę w metabolizmie komórki. Niacyna wchodzi w skład przenośnika elektronów NAD, który jest niezbędny do oddychania komórkowego, które sprawia, że produkujemy niezbędne do życia ATP. Niedobór niacyny może powodować pelagrę, której objawy to zmiany skórne (nazwa pochodzi od łacińskiego pellis aegra, czyli chora skóra), osłabienie, biegunka i porażenie kończyn.

Tiamina wchodzi w skład trzech enzymów związanych z metabolizmem (w biochemii mówi się, że jest grupą prostetyczną): dehydrogenazy pirogronowej, dehydrogenazy α-ketoglutaranowej i transketolazy. Z tej trójki najważniejsza jest dehydrogenaza pirogronowa, ponieważ umożliwia przejście od glikolizy, której końcowym produktem jest pirogronian, do cyklu kwasu cytrynowego, który zaczyna się od acetylo-koenzymu A. Jeżeli enzym ten ma obniżoną aktywność, cykl Krebsa nie jest w stanie wytworzyć ATP na większą skalę. I to właśnie dzieje się w przypadku beri-beri: niedobór witaminy B₁ powoduje, że komórki nie mogą wykorzystywać glukozy do produkcji ATP w cyklu Krebsa. Najbardziej narażone są komórki nerwowe, ponieważ jedynym źródłem energii dla nich jest glukoza. Niedobór ATP powoduje ich śmierć, czego skutkiem jest uszkodzenie układu nerwowego, charakterystyczne dla pacjentów chorych na ber-beri. Inne tkanki mogą wykorzystywać tłuszcz (Ryc. 2).

Ryc. 2. Struktury witaminy B₁(tiaminy) i witaminy B₃ (niacyny). Źródło: Wikipedia, domena publiczna.

Vitamine czy vitamin?

Zaproponowana przez Funka nazwa „witamina” (po angielsku vitamine) wzbudziła kontrowersje. Wiadomo już było, że tran zawiera substancję przeciwdziałającą kurzej ślepocie (czyli osłabieniu wzroku w ciemności). Była to opisana w 1913 r. mieszanina retinolu, retinalu i kwasu retinowego, później nazwana witaminą A. Substancje te nie są aminami, więc w 1920 r. Jack Drummond z Instytutu Badawczego Szpitala Onkologicznego na Uniwersytecie w Londynie zaproponował, żeby usunąć ostatnią literę z nazwy, i w ten sposób nie sugerować, że każda witamina jest aminą. Drummond zaproponował też, żeby witaminy oznaczać w kolejności odkrycia. Ostatecznie nazwa „vitamin” bez „e” przyjęła się w języku angielskim. W języku polskim mówi się po prostu „witamina”.

Nagroda Nobla 1929 r.

W 1929 r. Nagrodę Nobla z fizjologii i medycyny otrzymał Chistiaan Eijkman z Uniwersytetu w Utrechcie „za odkrycie witaminy hamującej zapalenie nerwów” i Frederick J. Hopkins z Uniwesrytetu w Cambridge „za odkrycie witamin stymulujących wzrost” (chodziło o witaminę A). W obu uzasadnieniach użyto słowa „witamina”, a Göran Liljestrand, szwedzki farmakolog, prezentując obu laureatów, wspomniał o pracach Funka, które przyczyniły się do odkrycia witamin. Również Frederick Hopkins w swoim wykładzie noblowskim powiedział, że zasługi Funka dla badań nad witaminami nie uzyskały wystarczającego uznania. Czy Funk powinien być trzecim laureatem? Moim zdaniem na pewno tak: on pierwszy wyizolował z otrąb ryżowych mieszaninę witaminy B₁ i B₃, wykazał ich dobroczynne działanie, oraz zaproponował, że w żywności znajdują się niskocząsteczkowe związki niezbędne do życia, które nazwał witaminami. Nie udało mu się ustalić struktury witamin, być może z powodu dość spartańskich warunków, w których zmuszony był pracować w Instytucie Listera. Dopiero w 1930 r. Barend Jansen i Willem Donath z Uniwersytetu w Utrechcie uzyskali z kilkuset kilogramów otrąb ryżowych czystą tiaminę i przedstawili jej wzór sumaryczny. W 1936 r. Robert Williams i J. K. Cline z Uniwersytetu w Chicago przeprowadzili totalną syntezę tiaminy i przedstawili jej wzór strukturalny. Ci sami autorzy zaproponowali nazwę „tiamina”, ponieważ związek jest aminą i zawiera pierścień tiazolowy (pięcioczłonowy związek zawierający siarki i azotu w pozycjach 1 i 3).

Angielska Wikipedia w haśle o Chistiaanie Eijkmanie pisze:

For his contributions to the discovery of antineuritic vitamins, Eijkman won the 1929 Nobel Prize for Medicine, sharing the prize with Sir Frederick Hopkins. Funk, perhaps unfairly, was never given full credit for his work.

(Za jego udział w odkryciu witamin hamujących zapalenie nerwów, Eijkman dostał Nagrodę Nobla w 1929 r., dzieląc ja z Sir Frederickiem Hopkinsem. Funk, zapewnie niesprawiedliwie, nigdy nie uzyskał pełnego uznania za swoją pracę).

Dalsza działalność

Po odejściu z Instytutu Listera, Funk wyjechał do USA, gdzie pracował w kilku laboratoriach, zajmując się m.in. syntezą leków przeciwbólowych i leków zwalczających kiłę (udało mu się ulepszyć salwarsan, pierwszy skuteczny lek przeciw tej chorobie). Do Polski wrócił w 1923 r., obejmując za namową Ludwika Rajchmana stanowisko kierownika Zakładu Biochemii w Państwowym Zakładzie Higieny (PZH). Jego faktycznym dyrektorem był wtedy rówieśnik Funka, Ludwik Hirszfeld.

Zajmował się tam badaniem witamin i enzymów trawiennych. Zapoczątkował produkcję insuliny, odkrytej dwa lata wcześniej przez Fredericka Bantinga i Charlesa Besta z Uniwersytetu w Toronto. Uzyskiwano ją z trzustek bydlęcych, produkcję udało się znacznie zwiększyć i rozpocząć nowatorskie wówczas leczenie cukrzycy za pomocą insuliny. Kazimierz Funk był więc pionierem leczenia cukrzycy w Polsce, ale chroniczne niedofinansowanie PZH uniemożliwiało dalszą rozbudowę laboratorium. Funk próbował sam zbierać fundusze, ale w końcu w 1927 r. zniechęcony wyjechał z Polski i nigdy już nie wrócił.

Osiadł w Paryżu, gdzie dzięki grantom stworzył prywatne laboratorium „Casa Biochemica”. Zajmował się tam m.in. badaniem hormonów płciowych, ale najważniejszym odkryciem było stwierdzenie, że czynnik przeciwdziałający anemii złośliwej znajduje się nie tylko w wątrobie (co było wówczas powszechnie przyjętą prawdą), ale również w drożdżach. Dziś wiemy, że była to kobalamina (witamina B₁₂), która wchodzi w skład kilku enzymów katalizujących m.in. przeniesienie grup metylowych z jednego związku na inny (np. przy syntezie metioniny). Witamina B₁₂ jest produkowana wyłącznie przez niektóre bakterie i archeony. Wszystkie zwierzęta muszą ją przyjmować z pokarmem, a wątroba jest głównym organem, który ją gromadzi. Odkryta przez Funka obecność witaminy B₁₂ w ekstrakcie drożdżowym wynikała z aktywności bakterii towarzyszącym drożdżom. Dalsze badania Funka nad tą witaminą przerwała II wojna światowa.

Nagrodę Nobla za wykazanie skuteczności leczenia anemii złośliwej za pomocą ekstraktów wątroby otrzymali w 1934 r. William Murphy i George Minot z Uniwersytetu Harvarda oraz George Whipple z Uniwersytetu w Rochester. Struktura witaminy B₁₂ została określona w 1956 r. przez Alexandra Todda i Dorothy Hodkin (oboje z Uniwersytetu w Cambridge). Dostali za to Nagrody Nobla z chemii w 1957 r. i 1964 r. (Ryc. 3).

Ryc. 3. Struktura witaminy B₁₂ (kobalaminy). Źródło: Wikipedia, domena publiczna.

Po wybuchu wojny Kazimierz Funk z rodziną wyjechał do USA, gdzie pracował w wielu laboratoriach, wciąż zajmując się przede wszystkim witaminami. Zmarł 19.11.1967 r. w Albany, NY, w wieku 83 lat.

Literatura dodatkowa

Pierwsza publikacja Funka z 1911 r. wykazująca, że ekstrakt w otrębów ryżowych leczy polineuropatię u ptaków

https://physoc.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1113/jphysiol.1911.sp001481?sid=nlm%3Apubmed

Książka „Die Vitamine” (1914 r.)

https://wellcomecollection.org/works/q42hs6rm/items

Kazimierz Funk po raz pierwszy o witaminach

https://pdfs.semanticscholar.org/fd38/43836639dddb3c380cdf50c70069b88d330d.pdf

Biografie Kazimierza Funka

https://kosmos.ptpk.org/index.php/Kosmos/article/view/1706

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022316622012317?via%3Dihub

https://karger.com/anm/article-abstract/57/2/85/41738/Casimir-Funk-His-Discovery-of-the-Vitamins-and?redirectedFrom=fulltext