Autor: Marcin Czerwiński

Bakterie też mogą złapać wirusa. Autor: Zuzanna Kaźmierczak

Marcin CzerwińskiLeave a comment

Autorką poniższego wpisu jest Zuzanna Kaźmierczak, moja koleżanka z Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN i specjalistka od biologii molekularnej bakteriofagów. Możliwe, że dołączy na stałe do grona autorów. Dziś gościnnie u mnie.

W przyrodzie występują wirusy infekujące ludzi, zwierzęta, rośliny, a nawet bakterie. Te patogeny mikrobów to bakteriofagi (Ryc.1.), nazywane w skrócie fagami. Pisał o nich na blogu Piotr Gąsiorowski.

Ryc.1. Zdjęcie elektronowe bakteriofaga T4 zdolnego do zabijania komórek bakteryjnych E. coli. Fot. Zuzanna Kaźmierczak.

Trochę historii

Pierwsze wyniki obserwacji dotyczące „cząstek” zdolnych do niszczenia bakterii zostały przedstawione przez angielskiego bakteriologa Ernesta Hankina w 1896 roku. Pracując w Indiach, zaobserwował on przeciwbakteryjne właściwości wód Gangesu. Swoje spostrzeżenia opublikował w „L’action bactericide des eaux de la Jumna et du Gange sur le vibrion du cholera”. Jednak za odkrywców bakteriofagów uznaje się angielskiego bakteriologa Federicka Tworta (odkrycie w roku 1915) oraz kanadyjskiego mikrobiologa urodzonego we Francji Félixa d`Hérelle`a (1917), którzy niezależnie prowadzili badania nad tymi „cząstkami” zdolnymi do niszczenia bakterii oraz wyizolowali je i scharakteryzowali.

W erze przedantybiotykowej odkrycie bakteriobójczych wirusów niosło nadzieję dla wielu chorych cierpiących z powodu infekcji bakteryjnych. D`Hérelle był pierwszą osobą, która użyła fagów w leczeniu ludzi z zakażeniami bakteryjnymi. W roku 1919 w paryskim szpitalu przebywał dwunastoletni chłopiec chory na czerwonkę. D`Hérelle zaproponował nowatorską terapię leczenia małego pacjenta polegającą na wypiciu preparatu bakteriofagów. W tamtych czasach nie było jeszcze żadnych dowodów na ich skuteczność. Brakowało również badań dotyczących możliwych efektów niepożądanych, a ponadto samo istnienie bakteriofagów wciąż było przedmiotem spekulacji. W celu udowodnienia bezpieczeństwa preparatu fagowego d`Hérelle i kilku jego stażystów wypili przygotowany terapeutyk. Nie wystąpiły żadne skutki uboczne, więc zdecydowano się podać chłopcu fagi. U dziecka objawy choroby
zaczęły ustępować w ciągu następnych 24 godzin, a pacjent wkrótce wyzdrowiał. Po zastosowaniu terapii fagowej w kolejnych latach następni lekarze zaczęli stosować fagi. Jednak, gdy w roku 1928 odkryto pierwszy antybiotyk – penicylinę, zaczęto prowadzić zakrojone na szeroką skalę badania nad tymi substancjami bakteriobójczymi i ostatecznie to one stały się środkiem leczniczym z wyboru przez kolejne dekady. Niemniej, w byłym Związku Radzieckim i Europie Wschodniej naukowcy nadal zajmowali się badaniami nad możliwością stosowania fagów w medycynie. Instytut Giorgiego Eliavy w Gruzji przeprowadził jedno z największych badań klinicznych: wzięło w nim udział ponad 30 000 dzieci. Badano zapobiegawcze zastosowanie terapii fagowej przeciwko dyzenterii bakteryjnej. Dzieci, którym podawano preparaty fagowe, wykazywały istotnie mniejszą częstość infekcji. Do chwili obecnej Instytut G. Eliavy kontynuuje badania nad terapią fagową, a wiele preparatów jest dostępnych na rynku (Ryc. 2,3.).

Ryc.2. Oryginalne historyczne preparaty fagowe stosowane w Instytucie G. Eliavy w Gruzji (Fot. Zuzanna Kaźmierczak).

Ryc.3. Niektóre ze współcześnie dostępnych preparatów fagowych w Instytucie G. Eliavy w Gruzji (Fot. Zuzanna Kaźmierczak).

W Polsce badaniami z zastosowaniem bakteriofagów zajmował się także prof. Ludwik Hirszfeld, założyciel i dyrektor Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu (IITD PAN). W roku 1948 wygłosił wykład zatytułowany: “Walka świata niewidzialnego z pozawidzialnym”, podczas którego przedstawił badania nad możliwością praktycznego stosowania fagów w medycynie. W tym samym roku opublikował pracę o zastosowaniu tych wirusów w diagnostyce duru brzusznego. Po śmierci Hirszfelda prof. Stefan Ślopek kontynuował badania nad fagami, m.in. aktywnymi wobec szczepów Shigella oraz stale wzbogacał kolekcję fagów IITD PAN utworzoną przez Hirszfelda. W latach 80. i 90. bakteriofagi były stosowane u dorosłych i dzieci w leczeniu zakażeń wywołanych przez bakterie Echerichia, Klebsiella, Pseudomonas, Proteus i Staphylococcus. Obecnie terapia fagowa jest prowadzona od roku 2005 w Ośrodku Terapii Fagowej (IITD PAN we Wrocławiu) utworzonym przez prof. Andrzeja Górskiego. W Ośrodku pacjenci są kwalifikowani do eksperymentalnej terapii fagowej, a leczenie prowadzi się zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez komisję bioetyczną. Ośrodek monitoruje również stan zdrowia pacjentów po zakończeniu terapii fagami.

Problem: antybiotykooporność

Obecnie ze względu na ogromny problem, jakim jest wciąż narastająca lekooporność bakterii, spowodowana m.in. nadużywaniem antybiotyków, bakteriofagi stanowią interesującą alternatywę w leczeniu zakażeń wywołanych przez bakterie oporne na antybiotyki. Bakteriofagi mają cechę, która czyni je szczególnie użytecznymi w porównaniu do antybiotyków. Antybiotyki zabijają różnorodne szczepy bakteryjne, włączając bakterie probiotyczne, podczas gdy fagi – ze względu na zdolność rozpoznawania konkretnych struktur na powierzchniach komórek bakteryjnych – są w stanie selektywnie zabijać określony gatunek, a nawet szczep bakterii. W efekcie podczas stosowania terapii fagowej możemy celować w określone bakterie, zabijając jedynie te patogenne przy zachowaniu probiotycznej mikrobioty. Liczne ośrodki w różnych zakątkach świata zajmują się badaniami nad biologią fagów oraz terapią z ich zastosowaniem. Jednym z najstarszych ośrodków jest wspomniany już wcześniej Instytut Eliavy w Gruzji. Również w Polsce w Ośrodku Terapii Fagowej IITD PAN we Wrocławiu jest obecnie prowadzona terapia z zastosowaniem bakteriofagów na zasadzie eksperymentu leczniczego u pacjentów, u których zastosowana antybiotykoterapia okazała się nieskuteczna lub jest przeciwwskazana, a wszystkie dostępne standardowe metody leczenia, które były zastosowane u pacjenta są niewystarczająco skuteczne. Szczegóły dotyczące kwalifikacji osób oraz stosowania fagów dostępne są na stronie internetowej Ośrodka Terapii Fagowej IITD PAN (OTF IITD PAN).

Inne zastosowania bakteriofagów

Ze względu na niezwykłe zdolności tych wirusów do selektywnego zabijania bakterii fagi znalazły zastosowanie również w dziedzinach innych niż medycyna, np. weterynaria, przemysł spożywczy, biotechnologia. 

Badania w dziedzinie weterynarii wykazują, że bakteriofagi są skuteczne w walce z chorobami takimi jak salmonelloza (powodowana przez bakterie Salmonella) i kampylobakterioza (Campylobacter) u drobiu lub zapalenie gruczołu mlekowego u krów (gronkowiec złocisty, Staphylococcus aureus). W badaniach dotyczących biologii fagów interesujący kierunek stanowią studia nad białkami, które tworzą kapsyd tych wirusów. Niektóre białka są zdolne do rozpoznawania konkretnych struktur na powierzchniach komórek bakteryjnych. Takie białka mogą być wykorzystywane jako biosensory. Standardowe metody wykrywania różnych gatunków bakterii, np. w pożywieniu, są czasochłonne, nietanie i złożone. Zastosowanie białek fagowych zdolnych do detekcji konkretnych struktur pochodzenia bakteryjnego (obecnych na zewnętrznej części komórek bakteryjnych) może pomóc przezwyciężyć ograniczenia dotychczas stosowanych metod detekcji. Bada się m.in. zastosowanie bakteriofagów w wykrywaniu patogenów powodujących zakażenie gruczołu mlekowego u bydła lub w przypadku określenia zakażenia konkretnych produktów spożywczych szczepami bakterii patogennych.

Fagi w przemyśle spożywczym

Bakteriofagi mogą być również stosowane w przemyśle spożywczym w celu wyeliminowania patogennych bakterii. W przypadku produktów pochodzenia zwierzęcego zagrożenie dla zdrowia ludzi stanowi bakterie z rodzaju Listeria. Po spożyciu zakażonego mięsa lub produktów mlecznych, bakterie te wywołują chorobę listeriozę, która charakteryzuje się występowaniem gorączki, nudności, biegunki, a czasami – szczególnie u osób z obniżoną odpornością – może doprowadzić do zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych lub sepsy. Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (Food and Drug Administration, FDA) w 2006 r. zatwierdziła użycie preparatu fagowego w przemyśle spożywczym w celu usuwania bakterii Listeria. Również w przypadku takich bakterii jak E. coli oraz Salmonella preparaty bakteriobójcze zawierające bakteriofagi wykazały wysoką skuteczność. Ze względu na selektywność działania fagów, mogą one być stosowane jako dodatki do żywności (zwłaszcza nabiału): zabijać szkodliwe szczepy bakterii przy jednoczesnym zachowaniu bakterii probiotycznych.

Białka fagowe jako czynniki bakteriobójcze

Nie tylko fagi, ale też ich białka mogą znaleźć zastosowanie w medycynie jako czynniki bakteriobójcze. Jednym z przykładów są endolizyny – białka obecne w bakteriofagach, zdolne do niszczenia składników ściany komórkowej bakterii takich jak peptydoglikan (inaczej mureina), który składa się z długich łańcuchów polisacharydowych, usieciowanych przez mostki peptydowe (Ryc.4.). Białka fagowe można poddawać modyfikacjom, np. w celu zwiększenia ich stabilności w wyższej temperaturze lub w celu poszerzenia spektrum bakteriobójczego. Prace badawcze w licznych ośrodkach w wielu krajach wykazują, że w przypadku, gdy bakterie nabędą cechy oporności na antybiotyk, np. wytwarzając enzym, który go rozkłada, to nie mogą nabyć oporności na białko bakteriofaga, które samo jest enzymem rozkładającym składnik ściany komórkowej bakterii. Należy jednak pamiętać, że bakterie nie są całkiem bezbronne wobec bakteriofagów i wytworzyły wiele metod obrony – enzymy restrykcyjne czy system CRISP to tylko niektóre przykłady.

Ryc. 4. Mechanizm działania endolizyn. Źródło: : Murray et al. 2021, Viruses 2021, 13(4), 680. Licencja: CC BY 4.0.

Przyszłość terapii chorób powodowanych przez bakterie?

Odkrycie wirusów o zdolnościach bakteriobójczych i efekty przeprowadzonych badań dotyczących ich biologii wniosły istotny wkład w rozwój wielu dziedzin, m.in. mikrobiologii, medycyny i biotechnologii. Bakteriofagi nadal są przedmiotem badań, a ich potencjał może być wykorzystywany w różnorodnych dziedzinach. Fagi stanowią doskonały przykład, jak jedno odkrycie wynikające z obserwacji otaczającego świata może wpłynąć na całą dziedzinę nauki i przyczynić się do poprawy zdrowia ludzi na całym świecie.

Literatura uzupełniająca

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/med.21593

https://europepmc.org/article/med/35248167

https://www.mdpi.com/1999-4915/13/4/680

http://www.przeglad-urologiczny.pl/artykul.php?3119

Kazimierz Funk, zapomniany odkrywca witamin

Marcin CzerwińskiLeave a comment

Kazimierz Funk. Źródło: Wikipedia, domena publiczna.

Witaminy znają wszyscy, ale mało kto wie, że słowo „witamina” zostało stworzone przez urodzonego w Warszawie Kazimierza Funka. On też jako pierwszy wykazał, że otręby ryżowe zawierają substancję, która zapobiega chorobie beri-beri, i zaproponował, że jest to witamina. Czterokrotnie nominowano go za to do Nagrody Nobla. Wśród Polaków, którzy na nią zasługiwali, ale nigdy jej nie dostali, on był chyba najbliżej. Tu kilka słów o nim.

Kazimierz Funk urodził się 23.02.1884 w Warszawie w rodzinie spolonizowanych Żydów. Studiował biologię na Uniwersytecie w Genewie i chemię na uniwersytecie w Bernie, gdzie w 1904 r. uzyskał stopień doktora. Później pracował w Instytucie Pasteura w Paryżu, na Uniwersytecie w Berlinie, w szpitalu w Wiesbaden, a w 1910 r. przeprowadził się do Londynu, gdzie podjął pracę w Instytucie Medycyny Zapobiegawczej Listera w Londynie. I tam zetknął się z problemem beri-beri.

Beri-beri i witaminy

W tym czasie powszechne były choroby spowodowane niedoborami pokarmowymi, takie jak szkorbut, beri-beri, krzywica czy pelagra. Szkorbutowi umiano już zapobiegać za pomocą soku z cytryn i limonek (pisała o tym Agnieszka Szuster-Ciesielska).

Ale beri-beri stanowiła ogromny problem, zwłaszcza w rejonach, gdzie podstawą żywienia był ryż. W chorobie tej ma miejsce osłabienie mięśni, drżenie rąk i nóg, chorobowe zmiany na skórze i powiększenie serca. Nazwa choroby pochodzi od słowa „owca” w języku hindi i odnosi się do niepewnego, chwiejnego sposobu chodzenia, który można zaobserwować u owiec. Uważano, że przyczyną tej choroby są bakterie, których jednak w żaden sposób nie udało się wyizolować. Pewną wskazówkę stanowiły badania Gerrita Gijnsa i Chistiaana Eijkmana z Uniwersytetu w Utrechcie. W 1906 r. zauważyli oni, że beri-beri pojawia się u osób, które żywią się głównie łuskanym (czyli pozbawionym otrąb) ryżem: pełnoziarnisty ryż nie dawał tych objawów. W otrębach ryżowych było więc coś, co przeciwdziałało powstaniu objawów beri-beri, ale Gijns i Eijkman początkowo byli przekonani, że ryż zawiera nieszkodliwy związek przerabiany przez bakterie jelitowe w toksynę wchłanianą do krwiobiegu i uszkadzającą układ nerwowy. Antidotum na tę toksynę miałoby się znajdować w otrębach. Poszukiwanie tej substancji nie przyniosło jednak rezultatów (Ryc. 1).

Ryc. 1. Pacjent z objawami beri-beri z południowo-wschodniej Azji oraz pierwsza strona książki Funka. Źródło: Casimir Funk, Die Vitamine, ihre Bedeutung für die Physiologie und Pathologie: mit besonderer Berücksichtigung der Avitaminosen: Beriberi, Skorbut, Pellagra, Rachitis. Verlag von J. F. Bergmann, Wiesbaden 1914. Domena publiczna.

W 1910 r. do Instytutu Medycyny Zapobiegawczej przyjechał William Braddon, brytyjski lekarz wojskowy zajmujący się chorobami tropikalnymi. Zasugerował on, że przyczyną beri-beri jest obecność w otrębach ryżowych jakiegoś aminokwasu, i to jego niedobór powoduje tę chorobę. Kazimierz Funk podjął się zadania wyizolowania tego związku i zbadania jego aktywności. W tym celu stworzył model badawczy, w którym gołębie karmione wyłącznie łuskanym ryżem zaczynały chorować na polineuropatię, która była ptasim odpowiednikiem beri-beri. Grupę kontrolną stanowiły gołębie karmione pełnoziarnistym ryżem.  Pracując w pojedynkę, wyizolował z kilkuset kilogramów otrąb ryżowych kilka gramów substancji, która w bardzo małym stężeniu przywracała zdrowie ptakom z doświadczalną polineuropatią. Stwierdził, że nie jest to aminokwas (mimo że zawiera grupę aminową), składa się z węgla, wodoru, tlenu i azotu oraz ma charakter zasadowy. Publikacja ukazała się w 1911 r. w Journal of Physiology.

Opierając się na znaczeniu tego związku dla życia, zaproponował dla niej nazwę „witamina” (od vita– życie i amine – związek zawierający grupę aminową). Dyrekcja Instytutu Listera była jednak sceptyczna co tego terminu i nie wyrażała zgody na jego używanie w publikacjach afiliowanych przy Instytucie. I tu pojawił się Ludwik Rajchman (kuzyn Ludwika Hirszfelda), kierownik Wydziału Bakteriologicznego w Królewskim Instytucie Zdrowia Publicznego w Londynie. Namówił on Funka na opublikowanie w Journal of State Medicine (którego był jednym z wydawców), co nie wymagało akceptacji Instytutu Listera. Praca ukazała się po angielsku w 1912 r. i po raz pierwszy jest w niej mowa o witaminach (jeszcze w wersji “vitamine” jako substancjach zapobiegających chorobom takim jak szkorbut, beri-beri, pelagra czy krzywica, która w tym czasie występowała u 50% dzieci z miejskich terenów Wielkiej Brytanii. Autor podkreślił w niej rolę zbilansowanej diety w profilaktyce tych chorób. Rozszerzona wersja tej publikacji ukazała się w 1914 r. po niemiecku jako książka „Witamina. Jej znaczenie w fizjologii i patologii, ze szczególnym uwzględnieniem awitaminoz (beri-beri, szkorbut, pelagra, krzywica”. Książka zyskała dużą popularność i była tłumaczona na wiele języków.

Witaminy B1 i B3

Co wyizolował Kazimierz Funk z otrąb ryżowych? Nie była to czysta witamina B1, bo w tych czasach było to jeszcze niemożliwe. Prawdopodobnie była to mieszanina niacyny, czyli kwasu nikotynowego i jego amidu (witamina B3) z tiaminą (witamina B1). Oba te związki pełnią ważną rolę w metabolizmie komórki. Niacyna wchodzi w skład przenośnika elektronów NAD, który jest niezbędny do oddychania komórkowego, które sprawia, że produkujemy niezbędne do życia ATP. Niedobór niacyny może powodować pelagrę, której objawy to zmiany skórne (nazwa pochodzi od łacińskiego pellis aegra, czyli chora skóra), osłabienie, biegunka i porażenie kończyn.

Tiamina wchodzi w skład trzech enzymów związanych z metabolizmem (w biochemii mówi się, że jest grupą prostetyczną): dehydrogenazy pirogronowej, dehydrogenazy α-ketoglutaranowej i transketolazy. Z tej trójki najważniejsza jest dehydrogenaza pirogronowa, ponieważ umożliwia przejście od glikolizy, której końcowym produktem jest pirogronian, do cyklu kwasu cytrynowego, który zaczyna się od acetylo-koenzymu A. Jeżeli enzym ten ma obniżoną aktywność, cykl Krebsa nie jest w stanie wytworzyć ATP na większą skalę. I to właśnie dzieje się w przypadku beri-beri: niedobór witaminy B1 powoduje, że komórki nie mogą wykorzystywać glukozy do produkcji ATP w cyklu Krebsa. Najbardziej narażone są komórki nerwowe, ponieważ jedynym źródłem energii dla nich jest glukoza. Niedobór ATP powoduje ich śmierć, czego skutkiem jest uszkodzenie układu nerwowego, charakterystyczne dla pacjentów chorych na ber-beri. Inne tkanki mogą wykorzystywać tłuszcz (Ryc. 2).

Ryc. 2. Struktury witaminy B1 (tiaminy) i witaminy B3 (niacyny). Źródło: Wikipedia, domena publiczna.

Vitamine czy vitamin?

Zaproponowana przez Funka nazwa „witamina” (po angielsku vitamine) wzbudziła kontrowersje. Wiadomo już było, że tran zawiera substancję przeciwdziałającą kurzej ślepocie (czyli osłabieniu wzroku w ciemności). Była to opisana w 1913 r. mieszanina retinolu, retinalu i kwasu retinowego, później nazwana witaminą A. Substancje te nie są aminami, więc w 1920 r. Jack Drummond z Instytutu Badawczego Szpitala Onkologicznego na Uniwersytecie w Londynie zaproponował, żeby usunąć ostatnią literę z nazwy, i w ten sposób nie sugerować, że każda witamina jest aminą. Drummond zaproponował też, żeby witaminy oznaczać w kolejności odkrycia. Ostatecznie nazwa „vitamin” bez “e” przyjęła się w języku angielskim. W języku polskim mówi się po prostu „witamina”.

Nagroda Nobla 1929 r.

W 1929 r. Nagrodę Nobla z fizjologii i medycyny otrzymał Chistiaan Eijkman z Uniwersytetu w Utrechcie „za odkrycie witaminy hamującej zapalenie nerwów” i Frederick J. Hopkins z Uniwesrytetu w Cambridge „za odkrycie witamin stymulujących wzrost” (chodziło o witaminę A). W obu uzasadnieniach użyto słowa „witamina”, a Göran Liljestrand, szwedzki farmakolog, prezentując obu laureatów, wspomniał o pracach Funka, które przyczyniły się do odkrycia witamin. Również Frederick Hopkins w swoim wykładzie noblowskim powiedział, że zasługi Funka dla badań nad witaminami nie uzyskały wystarczającego uznania. Czy Funk powinien być trzecim laureatem? Moim zdaniem na pewno tak: on pierwszy wyizolował z otrąb ryżowych mieszaninę witaminy B1 i B3, wykazał ich dobroczynne działanie, oraz zaproponował, że w żywności znajdują się niskocząsteczkowe związki niezbędne do życia, które nazwał witaminami. Nie udało mu się ustalić struktury witamin, być może z powodu dość spartańskich warunków, w których zmuszony był pracować w Instytucie Listera. Dopiero w 1930 r. Barend Jansen i Willem Donath z Uniwersytetu w Utrechcie uzyskali z kilkuset kilogramów otrąb ryżowych czystą tiaminę i przedstawili jej wzór sumaryczny. W 1936 r. Robert Williams i J. K. Cline z Uniwersytetu w Chicago przeprowadzili totalną syntezę tiaminy i przedstawili jej wzór strukturalny. Ci sami autorzy zaproponowali nazwę “tiamina”, ponieważ związek jest aminą i zawiera pierścień tiazolowy (pięcioczłonowy związek zawierający siarki i azotu w pozycjach 1 i 3).

Angielska Wikipedia w haśle o Chistiaanie Eijkmanie pisze:

 For his contributions to the discovery of antineuritic vitamins, Eijkman won the 1929 Nobel Prize for Medicine, sharing the prize with Sir Frederick Hopkins.  Funk, perhaps unfairly, was never given full credit for his work.

(Za jego udział w odkryciu witamin hamujących zapalenie nerwów, Eijkman dostał Nagrodę Nobla w 1929 r., dzieląc ja z Sir Frederickiem Hopkinsem. Funk, zapewnie niesprawiedliwie, nigdy nie uzyskał pełnego uznania za swoją pracę).

Dalsza działalność

Po odejściu z Instytutu Listera, Funk wyjechał do USA, gdzie pracował w kilku laboratoriach, zajmując się m.in. syntezą leków przeciwbólowych i leków zwalczających kiłę (udało mu się ulepszyć salwarsan, pierwszy skuteczny lek przeciw tej chorobie). Do Polski wrócił w 1923 r., obejmując za namową Ludwika Rajchmana stanowisko kierownika Zakładu Biochemii w Państwowym Zakładzie Higieny (PZH). Jego faktycznym dyrektorem był wtedy rówieśnik Funka, Ludwik Hirszfeld.

Zajmował się tam badaniem witamin i enzymów trawiennych. Zapoczątkował produkcję insuliny, odkrytej dwa lata wcześniej przez Fredericka Bantinga i Charlesa Besta z Uniwersytetu w Toronto. Uzyskiwano ją z trzustek bydlęcych, produkcję udało się znacznie zwiększyć i rozpocząć nowatorskie wówczas leczenie cukrzycy za pomocą insuliny. Kazimierz Funk był więc pionierem leczenia cukrzycy w Polsce, ale chroniczne niedofinansowanie PZH uniemożliwiało dalszą rozbudowę laboratorium. Funk próbował sam zbierać fundusze, ale w końcu w 1927 r. zniechęcony wyjechał z Polski i nigdy już nie wrócił.

Osiadł w Paryżu, gdzie dzięki grantom stworzył prywatne laboratorium „Casa Biochemica”. Zajmował się tam m.in. badaniem hormonów płciowych, ale najważniejszym odkryciem było stwierdzenie, że czynnik przeciwdziałający anemii złośliwej znajduje się nie tylko w wątrobie (co było wówczas powszechnie przyjętą prawdą), ale również w drożdżach. Dziś wiemy, że była to kobalamina (witamina B12), która wchodzi w skład kilku enzymów katalizujących m.in. przeniesienie grup metylowych z jednego związku na inny (np. przy syntezie metioniny). Witamina B12 jest produkowana wyłącznie przez niektóre bakterie i archeony. Wszystkie zwierzęta muszą ją przyjmować z pokarmem, a wątroba jest głównym organem, który ją gromadzi. Odkryta przez Funka obecność witaminy B12 w ekstrakcie drożdżowym wynikała z aktywności bakterii towarzyszącym drożdżom. Dalsze badania Funka nad tą witaminą przerwała II wojna światowa.

Nagrodę Nobla za wykazanie skuteczności leczenia anemii złośliwej za pomocą ekstraktów wątroby otrzymali w 1934 r. William Murphy i George Minot z Uniwersytetu Harvarda oraz George Whipple z Uniwersytetu w Rochester. Struktura witaminy B12 została określona w 1956 r. przez Alexandra Todda i Dorothy Hodkin (oboje z Uniwersytetu w Cambridge). Dostali za to Nagrody Nobla z chemii w 1957 r. i 1964 r. (Ryc. 3).

Ryc. 3. Struktura witaminy B12 (kobalaminy). Źródło: Wikipedia, domena publiczna.

Po wybuchu wojny Kazimierz Funk z rodziną wyjechał do USA, gdzie pracował w wielu laboratoriach, wciąż zajmując się przede wszystkim witaminami. Zmarł 19.11.1967 r. w Albany, NY, w wieku 83 lat.

Literatura dodatkowa

Pierwsza publikacja Funka z 1911 r. wykazująca, że ekstrakt w otrębów ryżowych leczy polineuropatię u ptaków

https://physoc.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1113/jphysiol.1911.sp001481?sid=nlm%3Apubmed

Książka „Die Vitamine” (1914 r.)

https://wellcomecollection.org/works/q42hs6rm/items

Kazimierz Funk po raz pierwszy o witaminach

https://pdfs.semanticscholar.org/fd38/43836639dddb3c380cdf50c70069b88d330d.pdf

Biografie Kazimierza Funka

https://kosmos.ptpk.org/index.php/Kosmos/article/view/1706

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022316622012317?via%3Dihub

https://karger.com/anm/article-abstract/57/2/85/41738/Casimir-Funk-His-Discovery-of-the-Vitamins-and?redirectedFrom=fulltext

Amanityna, czyli śmierć na grzybobraniu

Marcin Czerwiński6 komentarzy

Co roku wraz z sezonem grzybowym pojawia się problem zatruć grzybami. Grzyby potrafią produkować wiele biologicznie aktywnych związków chemicznych, takich jak muskaryny, fallotoksyny czy kwas ibutenowy. Wiele z nich zalicza się do trucizn. Niektóre są środkami psychoaktywnymi, jak np. psylocybina zawarta w łysiczce lancetowatej (Psilocybe semilanceata). Pisał o tym Lucas Bergowsky w artykule o narkotykach w służbie wywiadu.

Trujących grzybów jest bardzo dużo: samych muchomorów znanych jest ok. 600 gatunków, ale 90% śmiertelnych zatruć na świecie i 95% w Polsce jest wynikiem spożyciem muchomora zielonawego, dawniej znanego jako muchomor sromotnikowy (Amanita phalloides), lub gatunków z nim spokrewnionych, jak Amanita bisporigera (na wschodzie Ameryki Północnej) i Amanita ocreata (wybrzeże Pacyfiku). W Polsce muchomor zielonawy występuje pospolicie w lasach liściastych i mieszanych, a jego partnerem symbiotycznym jest dąb. Można go pomylić z jadalną gąską zielonką (Tricholoma equestre), bo oba grzyby mają blaszki pod kapeluszem i podobny kolor, ale tylko muchomor ma charakterystyczny pierścień na trzonie oraz pochwę, z której wyrasta owocnik. W Polsce ok. 50 osób rocznie umiera w wyniku zatrucia muchomorem zielonawym (Ryc.1).

Ryc. 1. Muchomor zielonawy (Amanita phalloides). Źródło: Wikpedia, Mushroom observer. Licencja CC BY 3.0.

Równie trujący jest muchomor jadowity (Amanita virosa). Różni się od muchomora zielonawego białym kolorem kapelusza, ale w Polsce jest bardzo rzadki, więc jest mała szansa, że ktoś na niego trafi i ugotuje.

Są jeszcze inne śmiertelnie trujące grzyby, ale nie przypominają znanych jadalnych gatunków. Tak więc głównym niebezpieczeństwem dla grzybiarzy jest muchomor zielonawy.

Co truje w muchomorze zielonawym?

Są w nim dwa rodzaje toksyn fallotoksyny i amatoksyny. Oba są cyklicznymi peptydami, z tym że fallotoksyny składają się z siedmiu reszt aminokwasowych, a amatoksyny z ośmiu. Amatoksyny są bardziej trujące: LD50 (dawka śmiertelna powodująca śmierć połowy badanych zwierząt) wynosi 0,1 mg/kg masy ciała dla amatoksyn i 2 mg/kg dla fallotoksyn. Mechanizm działania jest też różny: fallotoksyny wiążą się do F-aktyny, czyli polimerów aktyny w komórce. Amatoksyny hamują transkrypcję, czyli syntezę mRNA. I to właśnie one są przyczyną większości zgonów po zatruciu grzybami. Jest kilka rodzajów amatoksyn różniących się budową, ale w muchomorze zielonawym najwięcej jest α- i β-amanityny (Ryc. 2).

Ryc. 2. Struktura amatoksyn. Źródło: Barbarosa I et al., J. Phram. Biomed. Anal. 2023, 232: 115421. Licencja CC BY 4.0.

Jakie są objawy zatrucia amanityną?

Żeby spowodować śmierć dorosłego człowieka, wystarczy 7 mg amanityny. Przeciętny muchomor sromotnikowy może jej zawierać 15-30 mg, więc jednym grzybem może się zatruć kilkuosobowa rodzina. Pierwsze objawy mają miejsce się po 6-12 godzinach po zjedzeniu i są to zawroty głowy, wymioty i biegunka. Po tym okresie następuje pozorna poprawa trwająca 24 godziny, ale potem pojawia się żółtaczka (czyli żółte zabarwienie skóry), zaburzenia świadomości, śpiączka, zaburzenia w oddawaniu moczu, krwawe biegunki, uszkodzenie szpiku kostnego i serca. Ma też miejsce typowy dla uszkodzenia wątroby wzrost poziomu transaminaz (ALT/AST) i dehydrogenazy mleczanowej, także wydłużenie czasu protrombinowego, co ma związek z obniżeniem syntezy czynników krzepnięcia. Jeżeli chory nie otrzyma pomocy lekarskiej, śmierć następuje po kilku dniach.

Jaki jest mechanizm działania amanityny?

Toksyna wnika do komórek za pośrednictwem białka OATP1B3, które transportuje przez błonę komórkową rozpuszczalne cząsteczki organiczne (solute carrier organic anion transporter family member 1B3). Białko to przenosi przez błonę komórkową m.in. bilirubinę czy kwas cholowy, a jeżeli amanityna jest we krwi, przeniesie ją do wnętrza komórki. Tam amanityna wiążą się nieodwracalnie z polimerazą II RNA i hamuje transkrypcję. Proces ten polega na syntezie cząsteczki RNA w wyniku dodawania rybonukleotydów komplementarnych do deoksyrybonukletoydów na nici matrycowej DNA, i jest niezbędny, aby mogło powstać białko.

Polimeraza RNA II syntezuje RNA kodujące białka, czyli mRNA. W jej centrum aktywnym (czyli fragmencie odpowiedzialnym za aktywność enzymatyczną) znajdują się dwa ważne elementy: helisa mostkowa (bridge helix) i pętla cynglowa (trigger loop). W obecności jonu metalu (Mg2+) biorą one udział w przyłączaniu rybonukleotydów, czyli podjednostek tworzących RNA. Amanityna wiąże się do pętli cynglowej, zmieniając jej położenie wobec helisy mostkowej i uniemożliwiając w ten sposób syntezę RNA. Dotyczy to jednak tylko polimerazy RNA u kręgowców: enzymy innych gatunków mają inną budowę i nie są hamowane przez amanitynę. Dlatego muchomor syntezuje własne mRNA bez problemów; amanityna nie szkodzi też np. ślimakom (Ryc. 3).

Ryc. 3. Rola amanityny w hamowaniu polimerazy II RNA. Źródło: Liu X et al., J. Biol. Chem. 2018, 293: 7189-7194. Licencja CC BY 4.0.

A. Schemat syntezy RNA (rybonukleotydy w kolorze brązowym) na matrycy DNA (nić matrycowa: deoksyrybonukleotydy w kolorze granatowym; nić kodująca: kolor jasnoniebieski). Zaznaczono jon metalu (fioletowy), pętlę cynglową (bridge loop, kolor brązowy), helisę mostkową (bridge helix, kolor zielony) i amanitynę (kolor pomarańczowy).

B. Struktura kompleksu ludzkiej polimerazy RNA II w kompleksie z amanityną (C). Amanityna wiąże pętlę cynglową i helisę mostkową w polimerazie RNA II, co uniemożliwia przyłączenie kolejnego rybonukleotydu (kolor brązowy) do powstającej nici RNA. W wyniku tego synteza RNA ulega zatrzymaniu.

Zahamowanie transkrypcji powoduje obniżenie syntezy ważnych dla organizmu białek, takich jak enzymy wątrobowe czy czynniki krzepnięcia, co może prowadzić do zaburzeń w działaniu organizmu. Ale to nie te zmiany są przyczyną śmierci po spożyciu amanityny: toksyny jest za mało, żeby zahamować syntezę mRNA w całym organizmie. Natomiast zaburzenia w transkrypcji powodują uruchomienie mechanizmów apoptozy, czyli programowanej śmierci komórki, i to właśnie jest przyczyną toksyczności amanityny. Następuje ekspresja białka p53 i kilku innych białek związanych z apoptozą: skutkiem jest uwolnienie cytochromu c z mitochondriów, aktywacja kaspaz (enzymów degradujących białka) i śmierć komórki. Amanityny pośrednio generują też reaktywne formy tlenu powodujące stres oksydacyjny (pisałem o tym w tekście o niebezpieczeństwach związanych z jedzeniem bobu).

Można więc powiedzieć, że amanityna wprawdzie hamuje syntezę mRNA, ale to reakcja komórek na to zahamowanie powoduje fatalne skutki. Śmierć komórek w wyniku apoptozy daje opisane wyżej objawy zatrucia muchomorem zielonawym. Najbardziej narażona jest wątroba, ponieważ jej komórki mają najwięcej białek OATP1B3, które transportują amanitynę. Skutek jest fatalny: amanityna wnika do komórek wątroby i sieje zniszczenie (Ryc. 4).

Ryc. 4. Mechanizm działania α-amanityny. Toksyna po wniknięciu do komórki za pośrednictwem białka OATP1B3 wiąże się do centrum aktywnego polimerazy II RNA i hamuje jej działanie. Powoduje to aktywację białka p53 i uruchomienie apoptozy z uwolnieniem cytochromu c i aktywacją kaspaz. Powstają też reaktywne formy tlenu (ROS). Źródło: Barbarosa I et al., J. Phram. Biomed. Anal. 2023, 232: 115421. Licencja CC BY 4.0.

Co możemy zrobić w przypadku zatrucia muchomorem zielonawym?

Niewiele, ponieważ kiedy pojawiają się objawy, jest już przeważnie zbyt późno na interwencję (toksyna jest już w komórkach). Stosuje się wymianę płynów i elektrolitów, wymuszoną diurezę (czyli środki moczopędne), a także wlewy dożylne z sylibiny, która jest flawonoidowym związkiem pochodzącym z ostropestu plamistego (Silybum marianum) o działaniu przeciwzapalnym i przeciwutleniającym. Skuteczność tych zabiegów jest jednak niewielka. Śmiertelność w wyniku zatrucia wynosi ok. 50%.

Zieleń indocyjanowa jako antidotum na amanitynę?

W marcu 2023 r. autorzy artykułu opublikowanego w Nature Communications wykazali, że toksyczna aktywność amanityny w komórce zależy od N-glikozylacji, czyli przyłączania cukrów do białek. Okazało się, że jeden z enzymów biorących udział w tym procesie, znany pod skrótową nazwą STT3B  (podjednostka kompleksu glikozylotransferazy dolichol-białko; dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase subunit) jest niezbędny, aby amanityna mogła działać. Aktywność tego enzymu można zahamować za pomocą zieleni indocyjanowej, który jest fluorescencyjnym barwnikiem używanym od lat w diagnostyce medycznej. W badaniach na liniach komórkowych i myszach wykazano, że myszy przeżyją, jeżeli w ciągu ośmiu godzin od podania toksyny dostaną dożylnie zieleń indocyjanową. Rola glikozylacji w podatności na amanitynę jest tu trudna do wytłumaczenia, ale barwnik ten może być potencjalnym lekiem w przypadku zatrucia amanityną. Jest tylko jeden problem: objawy zatrucia amanityną pojawiają się najwcześniej po 6 godzinach i są dość łagodne. Wtedy można jeszcze interweniować. Przy poważnych objawach (36-48 godzin po spożyciu toksyny) jest już raczej za późno (Ryc. 5).

Ryc. 5. Zieleń indocyjanowa. Żródło: Wikipedia, domena publiczna.

Nie ma więc dobrej terapii dla osób zatrutych amanityną. Jeżeli dojdzie do uszkodzenia wątroby – jedynym ratunkiem jest jej przeszczep.

Jak się nie zatruć?

Amanityny są stabilne termicznie, więc nie ma mowy o pozbyciu się ich w wyniku gotowania czy smażenia. Chyba najlepiej unikać grzybów z blaszkami, z wyjątkiem tych, które można łatwo rozpoznać, jak kurki czy rydze. W USA dostępny jest test do wykrywania amatoksyn. Ale nawet mając wynik ujemny chyba lepiej nie ryzykować. Jest wiele innych smacznych grzybów.

Literatura dodatkowa

Amanityna: budowa, mechanizm działania, wykrywanie

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0731708523001905?via%3Dihub

Amanityna: mechanizm działania

https://www.mdpi.com/2072-6651/13/6/417

Struktura kompleksy polimeraz RNA II – amanityna

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021925820392048?via%3Dihub

Zieleń indocyjanowa jak antidotum na amanitynę

https://www.nature.com/articles/s41467-023-37714-3