Wirusoterapia jako skuteczne narzędzie walki z nowotworami

Wirusoterapia (wiroterapia) to wschodząca gałąź medycyny, która bada zastosowanie przeprogramowanych wirusów do leczenia różnych chorób, w tym nowotworowych.

Istnieją trzy główne kierunki wykorzystania wirusów w wiroterapii: przeciwnowotworowe wirusy onkolityczne, wektory wirusowe do terapii genowej i immunoterapia wirusowa.

Ale na początek wprowadzenie:

Do przeżycia i rozwoju komórek nowotworowych w guzie niezbędne jest wytworzenie własnych naczyń krwionośnych (angiogeneza) oraz wykształcenie się specyficznego mikrośrodowiska (malicious tumor microenvironment, TME). Tworzenie się nowych naczyń krwionośnych w guzie jest ważnym procesem we wzroście i przerzutowaniu nowotworów, i służy do transportu składników odżywczych oraz usuwania odpadów metabolicznych z komórek nowotworowych.

Komórki złośliwego guza rekrutują prawidłowe komórki, tworząc ostatecznie środowisko składające się z komórek nowotworowych, komórek śródbłonka, komórek odpornościowych, fibroblastów, makrofagów i macierzy zewnątrzkomórkowej otaczającej lub naciekającej tkanki nowotworowe, a także substancji rozpuszczalnych, takich jak cytokiny i czynniki wzrostu wydzielane przez te komórki – to właśnie nazywamy mikrośrodowiskiem nowotworu. Uważa się, że przyczyną niskiej skuteczności terapeutycznej obecnych leków przeciwnowotworowych jest wysoka, lokalna produkcja czynników napędzających unaczynienie guza, a także niedotlenienie (hipoksja). Niedotlenienie to niefizjologiczne obniżenie poziomu tlenu, zjawisko powszechne u większości nowotworów złośliwych. Hipoksja guza prowadzi do zaawansowanego, ale dysfunkcyjnego unaczynienia i nabycia takiego fenotypu komórkowego, które skutkuje wzrostem mobilności komórek i przerzutami.

I teraz …

Wirusy z powodu wywoływania straszliwych chorób były kiedyś kojarzone ze złym diabłem albo złośliwym gnomem, jednak wirusy onkolityczne (oncolytic viruses, OV) można porównać do szlachetnych aniołów, ponieważ mogą ratować życie. Wirusoterapia onkolityczna to nowatorskie podejście do leczenia nowotworów, w którym wirusy selektywnie replikują się w komórkach nowotworowych niszcząc je (onkoliza), a jednocześnie pozostawiając prawidłowe komórki nieuszkodzone. Początkowo, w XX wieku, badania prowadzone nad działaniem onkolitycznym opierały się na ogół na wirusach występujących naturalnie, takich jak wirus Zachodniego Nilu, wirus wścieklizny, żółtej febry, zapalenia wątroby. Później zaczęto modyfikować te wirusy za pomocą inżynierii genetycznej. Zmodyfikowane OV wyposażone w pożądane geny mogą wywierać głębokie działanie przeciwnowotworowe poprzez różne mechanizmy. Początkowo głównym celem rekonstrukcji wirusów była poprawa ich specyficzności wobec komórki docelowej, selektywnej replikacji i onkolizy. Dość szybko doceniono przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną specyficzną dla antygenów wirusowych podczas lizy (rozpadu) guza, co stanowi kolejną zaletę OV jako narzędzia immunoterapii. Dlatego też zaczęto zmieniać strategie w kierunku opracowania wektorów wirusowych w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej w nowotworach i przeciwdziałaniu złośliwemu mikrośrodowisku nowotworu. Możemy zatem wyobrazić sobie wirusy onkolityczne jako „żołnierzy” wyposażonych w różnorodną „wyrafinowaną broń”, aby radzić sobie w różnych sytuacjach, w tym dokonać maksymalnego uszkodzenia nowotworu.

Wyniki terapii z wykorzystaniem wirusów onkolitycznych zależą od trójstronnego wyścigu między replikacją wirusa, aktywacją immunologiczną i wzrostem guza. W przeciwieństwie do konwencjonalnej chemioradioterapii, OV precyzyjnie dokonują lizy komórek nowotworowych poprzez interakcję ze specyficznymi receptorami komórkowymi. Korzyści wynikające z różnych form śmierci komórkowej są różne ze względu na charakterystykę wektorów wirusowych i typ komórek nowotworowych, ale większość z nich może ostatecznie wywołać tzw. immunogenną śmierć komórek poprzez uwolnienie antygenów związanych z nowotworem i inicjacji przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej. Inicjacja odporności, wspomaganie infiltracji doguzowej komórek odpornościowych, odwrócenie immunosupresyjnego działania mikrośrodowiska – wirusy onkolityczne mogą używać wielu „broni”, aby systematycznie i kompleksowo zabijać nowotwory na wiele sposobów.

Nie można jednak ignorować faktu, że wirusy onkolityczne mogą same wywołać odpowiedź przeciwwirusową.  Dlatego wybór i projektowanie wektorów wirusów jest zróżnicowane i elastyczne, biorąc pod uwagę równowagę między wirusami, mikrośrodowiskiem nowotworu i odpornością gospodarza.

Do tej pory naukowcy przeprowadzili szereg przedklinicznych prób i badań klinicznych zarówno z naturalnie występującymi OV (np. reowirusem i wirusem pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej VSV), jak i genetycznie zmodyfikowanymi OV (np. adenowirusem, wirusem krowianki i wirusem opryszczki) z zachęcającymi efektami. Od preparatu H101 stosowanego w leczeniu raka jamy nosowo-gardłowej przyjętego w Chinach w 2005 r. po Delytact stosowany w leczeniu glejaka złośliwego zatwierdzonego w Japonii w 2021 r. Wirusy onkolityczne stopniowo znajdują swoje miejsce jako silna broń przeciwnowotworowa w leczeniu raka. Naukowcy odkryli, że OV idealnie nadają się do strategii skojarzonych, czyli w połączeniu z radio- i chemioterapią. Rozwój metod skojarzonych z zastosowaniem leków przeciwnowotworowych zapewnia synergiczne lub dodatkowe korzyści w walce z nowotworem, dla których wymagana jest walidacja kliniczna w drodze dobrze zaprojektowanych i statystycznie uzasadnionych badań klinicznych.

W wirusoterapii wykorzystuje się najczęściej cztery gatunki wirusów:

Wirus opryszczki pospolitej (herpes simplex virus, HSV) (Ryc. 1), jest wirusem otoczkowym z podwójną nicią DNA (double stranded DNA, dsDNA) jako materiałem genetycznym. Jego duży genom o długości co najmniej 150 kb zapewnia możliwość insercji (wbudowania) stosunkowo dużych, dodatkowych fragmentów DNA. Na powierzchni otoczki znajdują się cztery główne glikoproteiny wirusowe, gB, gD, gH i gL, umożliwiając wirusowi wiązanie z różnymi receptorami komórkowymi. Jako wirus cytolityczny, HSV może infekować wiele typów komórek nowotworowych i szybko się w nich replikować, łatwo rozprzestrzeniając wirusy potomne na kolejne komórki nowotworowe. W celu przeciwdziałania ewentualnej zjadliwości onkolitycznego HSV można zastosować leki, takie jak acyklowir. Mimo że ponad połowa populacji posiada przeciwciała neutralizujące tego wirusa, to nadal może on uniknąć odporności gospodarza za pomocą różnych mechanizmów, co czyni go idealnym wektorem. Obecnie HSV-1 (wirus opryszczki wargowej) jest jednym z najczęściej używanych szczepów OV, takich jak T-VEC, G207 i G47Δ. Wirus HSV-2 (wirus opryszczki genitalnej) również przyciąga coraz większą uwagę i jest obecnie przedmiotem badań. W przypadku onkolitycznego HSV-2 o nazwie OH2 rozpoczęto niedawno badania kliniczne I/II fazy na guzach litych.

Ryc. 1. Wirus opryszczki pospolitej (https://viralzone.expasy.org/5796)

Adenowirusy to bezotoczkowe wirusy o wymiarach 90–100 nm, składające się z genomu dsDNA o wielkości około 26–45 kb otoczonego dwudziestościennym kapsydem z charakterystycznymi wypustkami odpowiedzialnymi za identyfikację receptorów komórkowych (Ryc. 2). Te wypustki adenowirusa można zmodyfikować w celu selektywnego ukierunkowania do konkretnych komórek. Spośród łącznie 57 różnych serotypów, Ad2 i Ad5 są najpowszechniej stosowane jako adenowirusy onkolityczne.

E1A i E1B to kluczowe wczesne geny, które aktywują replikację i transkrypcję kolejnych genów wirusowych Ad2 i Ad5. Jednak mają one właściwości onkogenne, a zatem przed wykorzystaniem adenowirusów jako wektorów muszą być usunięte.  Adenowirusy są jednymi z najczęściej badanych wirusów, ponieważ szybko i wydajnie się replikują, można nimi łatwo manipulować i posiadają silną aktywność lityczną. Ponieważ adenowirus charakteryzuje się rozległym tropizmem tkankowym (może zakażać wiele różnych komórek), należy wzmacniać selektywną replikację adenowirusów tylko w komórkach nowotworowych w celu zapewnienia bezpieczeństwa biologicznego. Pierwszym rekombinowanym adenowirusem był szczep Onyx-015. Atenuację i warunkową replikację Onyx-015 uzyskano poprzez usunięcie genu E1B, blokując tym samym ekspresję onkogennego białka E1B-55kD. Ta delecja uniemożliwia replikację Onyx-015 w prawidłowych komórkach. Onyx-015 był badany w kilku badaniach klinicznych pod kątem różnych nowotworów, w tym glejaka złośliwego (stopień III i IV). Chociaż na podstawie analizy histologicznej w guzach zidentyfikowano naciekające limfocyty i komórki plazmatyczne (produkujące przeciwciała), to nie wykazano jednoznacznej odpowiedzi przeciwnowotworowej. Badania nad lekiem Onyx-015 ostatecznie przerwano po nieudanym badaniu III fazy z udziałem pacjentów z nowotworami głowy i szyi.

Ryc. 2. Adenowirus – uwagę zwracają “wyraziste” receptory powierzchniowe wirusa (https://viralzone.expasy.org/4)

Wirus krowianki to wirus dsDNA o wielkości około 190 kb, należący do rodzaju ortopokswirusów. Cząsteczka wirusa ma wymiar około 270 × 350 nm i wyglądem przypomina cegłę.  Selektywne ukierunkowanie wirusa krowianki jest w dużym stopniu zależne od kinazy tymidynowej, enzymu niezbędny do replikacji wirusa. Wirusowa kinaza zwykle ulega nadekspresji w komórkach złośliwych, ale rzadko w komórkach prawidłowych. W ten sposób naukowcy wygenerowali szczep wirusa krowianki z nokautem* genu kinazy, który replikuje się wyłącznie w komórkach nowotworowych. Do najważniejszych zalet wirusa krowianki należą dobrze poznany genom, szybkie i skuteczne rozprzestrzenianie się wirusa, a także możliwość insercji dodatkowych genów. Najsłynniejszy onkolityczny szczep wirusa krowianki JX-594 można podawać dożylnie, ponieważ opiera się działaniu przeciwciał i dopełniacza.

Ryc. 3. Wirus krowianki (ospy krowiej) (https://viralzone.expasy.org/174?outline=all_by_species)

Reowirus to bezotoczkowy wirus dsRNA, który przedostaje się do komórki gospodarza głównie poprzez endocytozę za pośrednictwem komórkowego receptora JAM-A (Ryc. 4). Okazuje się, że wiele komórek nowotworowych wykazuje nadekspresję tego receptora, np. w raku piersi, niedrobnokomórkowym raku płuc, chłoniaku rozlanym z dużych komórek B i szpiczaku mnogim (to zapewnia selektywność adhezji wirusa do komórek nowotworowych). Innym mechanizmem selektywnego atakowania przez reowirusa komórek nowotworowych jest dominująca mutacja genu/sygnalizacji RAS w nowotworach (odpowiadająca m.in. za unikanie apoptozy). Powoduje ona inaktywację komórkowej kinazy proteinowej R (protein kinase R, PKR), białka przeciwwirusowego, które reguluje translację mRNA oraz reguluje apoptozę i proliferację komórek. W prawidłowych komórkach, PKR może wiązać się z dsRNA reowirusa blokując jego replikację (czyli aktywność wirusa zostaje zahamowana, co jest niekorzystne). A zatem, w komórkach nowotworowych z zablokowaną funkcją PKR nie będzie dochodziło do hamowania replikacji onkolitycznego reowirusa, który będzie powodował ich lizę. Szczep reowirusa Dearing typu 3 (T3D) został wykorzystany do stworzenia komercyjnego wirusa onkolitycznego o nazwie Reolysin. Jest przeznaczony do stosowania dożylnego i prezentuje silne działanie przeciwnowotworowe, nie wykazując żadnej toksyczności ani podrażnienia, które mogłoby ograniczyć dawkę.

Ryc. 4. Reovirus (https://viralzone.expasy.org/105)

Jak wygląda szkolenie wirusów dzikich (występujących naturalnie) na „wykwalifikowanych żołnierzy”?

Po pierwsze – poprawa selektywności wirusów ukierunkowanej na nowotwór

Szkolenie wirusów typu dzikiego na wyspecjalizowane wirusy onkolityczne specyficzne dla nowotworu jest warunkiem wstępnym, który można opisać jako szkolenie cywilów na rekrutów, co może nastąpić albo w procesie infekcji, albo replikacji. Proces szkolenia należy przeprowadzić zgodnie z charakterystyką samych wirusów oraz komórek nowotworowych. Różne gatunki wirusów wykazują odmienne naturalne powinowactwo i preferencje do replikacji w różnych komórkach nowotworowych, podczas gdy genetycznie zmodyfikowane wirusy onkolityczne zaprojektowano z myślą o zwiększonej zdolności celowania w nowotwory. Istnieją dwie główne strategie takich modyfikacji; pierwszym jest zwiększenie powinowactwa i aktywności wiązania wirusów z receptorami na powierzchni nowotworu, u którego ulegają one nadekspresji (jak w przypadku nowotworu piersi). Alternatywnie dokładność celu można zwiększyć poprzez wykorzystanie charakterystyki komórek nowotworowych w celu selektywnej poprawy wydajności replikacji wirusa. Przykłady?

Ze względu na zmienione szlaki sygnalizacyjne w komórkach nowotworowych, ekspresja niektórych receptorów ulega zwiększeniu. Na przykład CD155 ulega nadekspresji na powierzchni wielu komórek nowotworowych, co sprzyja ich inwazji i migracji. Tak się składa, że jest to naturalny receptor dla wirusa polio, dzięki któremu wirus polio może selektywnie infekować komórki nowotworowe. Z kolei białko powierzchniowe gD wirusa opryszczki wiąże się z jego komórkowym mediatorem wejścia (HVEM), którego gęstość na powierzchni komórek jest zwiększona w przypadku czerniaka, raka żołądka i raka wątrobowokomórkowego.

Po drugie – zwiększanie wydajności replikacji wirusów onkolitycznych w cytoplazmie komórek nowotworowych

Poprawa zdolności replikacji wirusów litycznych jest skutecznym podejściem do opracowania ukierunkowanych terapii przeciwwirusowych. Niektóre wirusy mają własne mechanizmy sprzyjające replikacji. Na przykład białko B18R wytwarzane przez niektóre ortopokswirusy blokuje podjednostkę α receptora dla interferonu, hamując odpowiedź przeciwwirusową komórek i promując replikację wirusa. Z kolei mutacja w genie α47 wirusa opryszczki powoduje wczesną ekspresję genu US11, który indukuje replikację wirusa w komórkach nowotworowych – dlatego tak zmodyfikowany onkolityczny wirus opryszczki został zatwierdzony przez Agencję ds. Żywności i Leków (Food and Drug Administration, FDA) jako pierwsza wirusoterapia w leczeniu czerniaka (preparat Talimogene laherparepvec, T-VEC).

Zarówno utrata genów supresorowych nowotworu, jak i rozregulowanie szlaków sygnalizacyjnych w komórkach nowotworowych pomogłyby w selektywnej replikacji wirusa. W przypadku adenowirusów gen kodujący E1B, który może utrzymywać wirusa przy życiu w komórkach, został usunięty w wielu onkolitycznych wirusach, takich jak szczepy adenowirusów H101 i ONYX-015. Jaka jest z tego korzyść? W przypadku infekcji komórek prawidłowych tak zmodyfikowanymi adenowirusami dochodzi do ich apoptozy ze względu na prawidłowe działanie białka p53 (jest to przeciwwirusowa obrona komórki). Z kolei w komórkach nowotworowych białko p53 jest często zmutowane, a zatem komórka nie podlega apoptozie i wirus może litycznie się replikować.

Po trzecie – bezpieczeństwo wirusów onkolitycznych

Wirusy od dawna są postrzegane jako mikroorganizmy chorobotwórcze. Z tego względu kwestionowano bezpieczeństwo wirusów onkolitycznych, zwłaszcza naturalnych (bez modyfikacji), które, jak udowodniono, zabijając komórki nowotworowe niszczą jednocześnie komórki prawidłowe. Dlatego też, należy wprowadzić odpowiednie modyfikacje wirusów onkolitycznych w celu zwiększenia ich bezpieczeństwa dla pacjenta.

A. „Zimna broń” – onkowirusy jako włócznia precyzyjnie wycelowana w komórki nowotworowe

Kiedy wreszcie „wykwalifikowani żołnierze” nabędą umiejętności precyzyjnego namierzenia celu, selektywnej replikacji i będą bezpieczni dla organizmu, są proszeni o zabranie broni do walki z komórkami nowotworowymi. O co chodzi?

Przez ostatnie dziesięciolecia mechanizmy przeciwnowotworowe wirusów onkolitycznych skupiały się głównie na bezpośredniej lizie transformowanych komórek. Jednak tego typu śmierć nie jest korzystna dla organizmu, ponieważ wyzwala reakcje zapalne (czy na pewno? O tym będzie dalej).

Apoptoza, nazywana cichą i spokojną śmiercią komórki, może być wywoływana przez spotkanie tzw. komórkowych „receptorów śmierci” z odpowiednimi ligandami (czyli cząsteczkami, które przyłączając się do tych receptorów indukują apoptozę). Na początkowym etapie infekcji różne wirusy mogą manipulować specyficznymi czynnikami sygnalizacyjnymi w komórkach nowotworowych, aby zahamować apoptozę, zapewniając sobie wystarczający czas i przestrzeń na replikację i reprodukcję. Dlatego, naukowcy „włączają” do specyficznych wobec komórek nowotworowych wirusów białka mające za zadanie połączenie się z “receptorami śmierci” i wywołanie apoptozy tych transformowanych komórek – to jest właśnie ta „zimna broń” (czyli śmierć bez wywołania efektu zapalnego).

Autofagia jest dwulicowym mechanizmem – może utrzymać komórkę przy życiu w warunkach stresowych lub doprowadzić do jej śmierci bez inicjacji procesu zapalnego. Dlatego nie jest łatwym celem w badaniach dotyczących terapii przeciwnowotworowych.

W niektórych eksperymentach próbowano uzbroić wirusy w cząsteczki związane z promocją autofagii, jak na przykład beklinę-1, najczęściej stosowane białko w modyfikacji. Uzbrojenie w beklinę-1 znacząco zwiększało skuteczność terapeutyczną wirusów poprzez indukcję śmierci komórek w hematologicznej białaczce nowotworowopodobnej i szpiczaku. Inne strategie również wskazywały, że może dochodzić do wzmocnienia autofagii komórek nowotworowych jako mechanizmu śmierci. Na przykład szczep onkolitycznego HSV-1 RH2 z niedoborem genu γ34.5 indukował powstawanie autofagosomu i śmierć komórek raka płaskonabłonkowego.

B. „Gorąca broń” – magiczna armata odpornościowa

Naukowcy w coraz większym stopniu skupiają się na immunogenności onkolitycznej wirusów. Dlaczego? Zaraz po lizie komórek nowotworowych uwalniane są potomne wirusy wraz wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami (Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs) i sygnałami DAMPs (Damage-associated molecular patterns – białka, które w zdrowej komórce są zamknięte wewnątrz niej i nie wzbudzają reakcji odpornościowych). PAMPs i DAMPs nakręcają odporność wrodzoną poprzez wiązanie się z receptorami, takimi jak Toll-podobne (Toll-like receptors, TLR) oraz stymulują komórki dendrytyczne i limfocyty NK (natural killer). Te ostatnie wspomagają wirusy w niszczeniu komórek nowotworowych. Natomiast komórki dendrytyczne wychwytują białka wirusowe, aby wywołać odporność adaptacyjną. W efekcie prezentacji antygenów wirusowych przez komórki dendrytyczne limfocytom T, z najbliższych węzłów chłonnych napływają limfocyty T pomocnicze i cytotoksyczne, aby wspomóc walkę z komórkami nowotworowymi. Do tego sama obecność wirusów może stymulować wytwarzanie czynników zapalnych (np. IL-2, IL-12, IL-15, TNF-α) i chemokin (np. CXCL9, CXCL10, CXCL11) przyciągających limfocyty. Jednak problemem jest to, że aktywność naciekających komórek odpornościowych jest hamowana przez komórki immunosupresyjne mikrośrodowiska guza (np. makrofagi związane z nowotworem) i lokalnie produkowane cytokiny przeciwzapalne (np. IL-10, TGF-β). Na szczęście zaproponowano pewne działania pozwalające zmienić „zimny” guz w guz objęty stanem zapalnym, czyli immunologicznie „gorący”. W jaki sposób? Przedstawiono to na poniższej rycinie 5, ale najpierw wyjaśnię, co to jest macierz zewnątrzkomórkowa (extracellular matrix, ECM) „otulająca” guz.

Jako główny składnik mikrośrodowiska guza, macierz zewnątrzkomórkowa zapewnia niszę wzrostową dla większości guzów litych. Tworzy barierę fizyczną i odgrywa kluczową rolę w inicjacji, progresji, przerzutach i lekooporności nowotworu. Wśród nich działanie immunosupresyjne (hamujące odpowiedź immunologiczną) jest głównym mechanizmem progresji nowotworu i niepowodzenia leczenia. Odkładanie się różnych składników wydzielanych przez ECM (np. kolagenu i włókien elastycznych) oraz przebudowa macierzy negatywnie wpływają na naciekanie komórek odpornościowych. Klasycznym przykładem jest macierz zewnątrzkomórkowa gruczolakoraka przewodowego trzustki nazywana „pustynią immunologiczną”. Tradycyjna chemioterapia i ukierunkowana terapia molekularna może utrzymać średni czas przeżycia pacjenta z nieoperacyjnym gruczolakorakiem jedynie przez kilka miesięcy. Naukowcy zdali sobie sprawę, że ECM może służyć jako obiecujący cel terapii przeciwnowotworowych w takich nowotworach, jak rak piersi HER2-dodatni czy glejaki o wysokim stopniu złośliwości, chociaż obecnie nie jest dostępny żaden zatwierdzony lek ukierunkowany na ECM.

Ryc. 5. Przekształcanie guza “zimnego” w guz “gorący” (https://www.nature.com/articles/s41392-023-01407-6#Tab3).

Opis ryciny 5:

Silna immunogenność onkolityczna zmodyfikowanych OV. ① Kiedy OV degradują komórki nowotworowe, jednocześnie uwalniane są wirusy potomne, PAMPs i DAMPs, co wyzwala immunologiczną śmierć komórkową. ② W międzyczasie inicjowana jest odporność wrodzona, gdy komórki dendrytyczne i limfocyty NK współpracują przy usuwaniu komórek guza. ③Komórki dendrytyczne wraz z pochłoniętymi antygenami nowotworowymi szybko migrują do węzłów chłonnych, gdzie aktywowane są limfocyty T, które naciekają ogniska pierwotne i przerzutowe, aby zapewnić odporność nabytą. ④ Ponadto zmodyfikowane OV mają zdolność przełamywania bariery macierzy zewnątrzkomórkowej „otulającej” guz, pobudzając komórki mikrośrodowiska guza do uwalniania czynników zapalnych i chemokin, co odwraca jego immunosupresyjny charakter. ⑤ Dzięki temu wspólnemu wysiłkowi zmodyfikowane OV mogą przekształcić immunologicznie „zimny” guz w „gorący” guz, co przekłada się na ulepszoną i silniejszą odporność przeciwnowotworową.

Pojawienie się leków celowanych wskazuje, że terapia nowotworów wkroczyła w erę medycyny precyzyjnej. Prowadzoną są badania, w których łączy się wirusy onkolityczne z lekami celowanymi. Ze względu na różną biofunkcję leków, dzieli się je głównie na inhibitory angiogenezy, blokujące tworzenie nowych naczyń krwionośnych (np. sorafenib, bewacyzumab), przeciwciała monoklonalne celujące w komórki nowotworowe (np. trastuzumab, cetuximab), inhibitory proteasomów. (np. bortezomib), inhibitory przekazywania sygnału (np. imatynib), inhibitory deacetylazy histonowej (np. worinostat, belinostat), inhibitory naprawy DNA (np. olaparyb). Alternatywnie, leki te można je podzielić na drobnocząsteczkowe lub wielkocząsteczkowe na podstawie ich masy cząsteczkowej. Leki drobnocząsteczkowe mogą przedostawać się do komórek i specyficznie blokować lub konkurować o kluczowe cząsteczki zaangażowane w docelowy szlak sygnalizacyjny, aby mogły odgrywać rolę terapeutyczną. Leki wielkocząsteczkowe zwykle celują w białka błon komórkowych.

​Obecnie do obrotu dopuszczone są tylko cztery produkty zawierające wirusy onkolityczne: Rigvir (SND005), Oncorine (H101), Imlygic (Talimogene laherparepvec, T-VEC) i Delytact (teserpaturev/G47Δ).

Rigvir (SND005) to niezmodyfikowany cytopatyczny ludzki sierocy wirus jelitowy typu 7 (ECHO-7), zatwierdzony do leczenia czerniaka na Łotwie w 2004, co czyni go pierwszym zatwierdzonym lekiem onkolitycznym. W 2006 roku w Chinach zarejestrowano adenowirusa Oncorine (H10113) do leczenia raka płaskonabłonkowego głowy, szyi i przełyku. Jednakże skuteczność leczenia tymi wirusami wynika przede wszystkim z ich wrodzonych właściwości onkolitycznych, a nie ze stymulacji odporności przeciwnowotworowej. Dlatego efekt terapeutyczny stosowania jednego leku jest nadal ograniczony, a strategia leczenia koncentruje się bardziej na terapiach skojarzonych.

W 2015 roku amerykańska FDA zatwierdziła T-VEC, atenuowany wirus opryszczki HSV-2 kodujący czynnik wzrostowy dla granulocytów i makrofagów GM-CSF do miejscowego leczenia nieresekcyjnych zmian skórnych, podskórnych i węzłowych u pacjentów z nawrotowym czerniakiem. Niedawno zatwierdzony OV Delytact (G47Δ) (2021 r, Japonia) wykazał korzyści w zakresie wydłużenia czasu przeżycia pacjentów z resztkowym lub nawrotowym glejakiem wielopostaciowym, przy dobrym profilu bezpieczeństwa.

Do 2022 r. na stronie ClinicalTrials.gov zarejestrowano łącznie 329 badań klinicznych związanych z wirusami onkolitycznymi.

​Badania nad wirusoterapią wiążą się z wyzwaniami, ponieważ zmniejszenie odporności pacjenta onkologicznego osłabia też reakcję na terapię wirusami onkolitycznymi. Co więcej, istnieje pilna potrzeba opracowania modeli nowotworów, które dokładnie odzwierciedlałyby to, co dzieje się zarówno w guzie zakażonym wirusem onkolitycznym, jak i u gospodarza jako całego organizmu.

* Nokaut genowy – obecnie jest to fundamentalna technika inżynierii genetycznej, która pozwala na unieczynnienie wybranego genu badanego organizmu, a następnie na podstawie obserwowanego efektu fenotypowego umożliwia określenie jego funkcji. Technika ta wykorzystywana jest do tworzenia modeli zwierzęcych służących do badania ludzkich chorób i testowania różnych możliwości ich leczenia. Jak dotąd stworzono ponad 500 mysich modeli różnych chorób, w tym schorzeń sercowo-naczyniowych, chorób neurodegeneracyjnych, cukrzycy i wielu typów raka. Za wprowadzenie tej techniki Mario R. Capecchi (USA), sir Martin Evans (Wielka Brytania) i Oliver Smithies (USA) otrzymali w roku 2007 medycznego Nobla.

Źródła:

  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7526376/
  2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2746528/
  3. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0923753421010760
  4. https://www.nature.com/articles/s41571-022-00719-w
  5. https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/21645515.2020.1840887
  6. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3730429/
  7. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3888062/
  8. http://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-terms?cdrid=457964
  9. http://www.amsj.org/archives/3390
  10. https://www.daiichisankyo.com/files/news/pressrelease/pdf/202106/20210611_E_47.pdf

Wirusy brodawczaków ludzkich (HPV) a rak szyjki macicy

(Poniższy tekst jest częścią przygotowywanej publikacji naukowej, stąd Autorka zastrzega prawa autorskie i nie wyraża zgody na kopiowanie, przetwarzanie tekstu oraz rycin, które wykonała).

Charakterystyka rodziny Papillomaviridae

Wirusy brodawczaka ludzkiego obejmują szeroko rozproszoną grupę bezotoczkowych wirusów kręgowców, które w charakterystyczny sposób wywołują zmiany hiperproliferacyjne skóry i błon śluzowych. Rodzina Papillomaviridae obejmuje dwie podrodziny, Firstpapillomavirinae z ponad 50 rodzajami oraz Secondpapillomavirinae z jednym rodzajem. Rodzaje nazywane są wg alfabetu greckiego, począwszy od Alphapapillomavirus. Papillomawirusy w obrębie rodzaju mające 60%–70% identyczności sekwencji aminokwasowej białka L1 nazywane są gatunkami. Dodatkowo w obrębie gatunku za typ uważa się wirusy o 71%–89% identyczności tej sekwencji.

Wirusy papilloma bardzo dobrze przystosowały się do gospodarzy i w większości przypadków utrzymują się w populacji gospodarzy bez widocznych objawów klinicznych. Te cechy sugerują, że interakcje z tymi wirusami są bardzo stare i doprowadziły do wykształcenia się równowagi pomiędzy wirusami i gospodarzem. Rzeczywiście, ewolucyjne pochodzenie papillomawirusów można prześledzić już od owodniowców (350 mln lat temu). U ludzi zidentyfikowano ponad 200 genotypów wirusów brodawczaka (human papilloma virus, HPV) należących do pięciu rodzajów: Alphapapillomavirus, Betapapillomavirus, Gammapapillomavirus, Mupapillomavirus i Nupapillomavirus. Z tych ponad 200 genotypów 40 infekuje okolice narządów płciowych, jamę ustną i gardło, a co najmniej 14 jest onkogennych, stąd wśród HPV wyróżnia się wirusy wysokiego (high risk HPV, hrHPV) i niskiego ryzyka (low risk HPV, lrHPV) onkogenezy. Chociaż najlepiej poznana została biologia i chorobotwórczość przedstawicieli rodzaju Alphapapillomavirus, to w każdym z pięciu rodzajów HPV obecne są wirusy powodujące choroby człowieka, w tym nowotwory.

Wiriony HPV są bezotoczkowe i składają się z dwudziestościennych kapsydów zawierających dsDNA. Kapsyd wirusa o średnicy 52-55 nm tworzony jest przez białka zewnętrzne, nazywane głównymi lub dużymi białkami kapsydu (L1), oraz wewnętrzne, określane jako małe białka kapsydu (L2) – są to jedyne białka strukturalne HPV (Ryc. 1). Dwudziestościenny kapsyd ma duży stopień elastyczności i składa się z 360 kopii białka L1 oraz 12–72 kopii białka L2.  Genomy wirusów HPV o okrągłym kształcie mają wielkość w granicach od 5 ,748 do 8 .607 kb (kilobase*) i replikują się w jądrach komórek gospodarza. W kapsydach materiał genetyczny jest związany z histonami komórkowymi, tworząc struktury podobne do chromatyny.

Rycina 1. Struktura wirionu papillomawirusa. Kolisty ds DNA stanowi rdzeń wirionu umieszczony w ikosaedralnym kapsydzie zbudowanym z białek L1 i L2 tworząc nukleokapsyd. Materiał genetyczny jest zasocjowany z białkami histonowymi gospodarza. *kb – kilozasada (ang. kilobase) to jednostka miary używana do określania długości DNA lub RNA. Jedna kilozasada jest równa 1000 zasad.(A.Szuster-Ciesielska, BioRender.com).

Właściwości wirusów HPV:

  • HPV jest odporny na wyższą temperaturę i wysuszanie (wirus bezotoczkowy) i zachowując zakaźność może przetrwać na przedmiotach, takich jak odzież i sprzęt laboratoryjny, które miały kontakt z zakażonymi pacjentami, chociaż dokładny czas przeżycia nie jest znany.
  • Wrażliwość na fizyczną inaktywację zmienia się w zależności od różnych szczepów, ale ogólnie są wrażliwe na promieniowanie UV, a do ich inaktywacji wystarczy podgrzanie do temperatury 100°C.
  • Wrażliwość na chemiczne środki dezynfekujące – działanie 90% etanolu przez co najmniej 1 minutę, 2% aldehydu glutarowego lub 1% podchlorynu sodu może inaktywować patogen.
  • Obecnie wobec HPV nie istnieje żadna skuteczna terapia przeciwwirusowa.

Patogeneza

Podstawą patogenezy wirusów HPV jest dotarcie do komórek błony podstawnej skóry lub błon śluzowych. A zatem warunkiem musi być naruszenie ich integralności poprzez skaleczenie, otarcie lub mikrouszkodzenia. Papillomawirusy transmitują się poprzez bliski kontakt typu skin-to-skin, bardzo często drogą seksualną (seks pochwowy, analny, oralny) lub z matki na dziecko (Ryc. 2).

Rycina 2. Źródła i drogi transmisji wirusów brodawczakowych. *Grupa MSM (men-sex-men) – mężczyźni uprawiający seks z mężczyznami. A.Szuster-Ciesielska, BioRender.com).

Transmisja drogą okołoporodową

Przy wysokiej częstości występowania (44,9% przypadków) HPV w badaniach prenatalnych u młodych ciężarnych kobiet często także wykrywano wirusa w próbkach łożyska (14%) i u noworodków (11,2%). Do zakażenia wertykalnego może dojść w życiu płodowym poprzez zakażenie wstępujące (przeniesienie przezłożyskowe), podczas porodu drogą pochwową, podczas cięcia cesarskiego lub w okresie okołokoncepcyjnym (trzy miesiące przed zajściem w ciążę i trzy miesiące po zapłodnieniu) od zakażonego partnera seksualnego. Po narodzinach dziecko może nabyć HPV poprzez karmienie piersią lub w wyniki kontaktu bezpośredniego. Potwierdzono, że okołoporodowa transmisja noworodkom HPV niskiego ryzyka jest związana z rozwojem nawracającej brodawczakowatości dróg oddechowych. W próbkach tkanek pobranych od dzieci z przerostem migdałków, przewlekłym zapaleniem migdałków, ale prawidłową błoną śluzową wykrywano także HPV wysokiego ryzyka (typ 16 i 18). Dzieci mogą zatem stanowić rezerwuar „cichych” wirusów wysokiego ryzyka, co może być kluczem do przetrwania HPV i związanej z nim karcynogenezy w wieku dorosłym.

Transmisja poprzez autoinokulację

Do autoinokulacji między genitaliami a jamą ustną lub odbytem może dojść w wyniku pośredniego kontaktu z rękami lub w wyniku rozsiewania wirusa w okolicy odbytowo-płciowej. Istnieją pewne rozbieżności w piśmiennictwie dotyczące częstości występowania HPV w jamie ustnej u kobiet z zakażeniem HPV szyjki macicy. Kobiety z potwierdzonym zakażeniem HPV szyjki macicy, dysplazją szyjki macicy lub rakiem inwazyjnym mają większą częstość występowania HPV w próbkach jamy ustnej, co wskazuje na związek między takimi infekcjami. Stąd pacjenci z zakażeniem HPV narządów płciowych są narażeni na ryzyko zakażenia jamy ustnej, a w konsekwencji do rozwoju raka jamy ustnej i gardła. Jednak według innych autorów korelacja między kolonizacją szyjki macicy i jamy ustnej przez HPV jest niska, dlatego jednoczesne badanie infekcji HPV jamy ustnej i gardła oraz szyjki macicy nie wydaje się obiecujące jako przyszła strategia przesiewowa.

Transmisja drogą seksualną

Transmisja drogą seksualną obejmuje seks waginalny, oralny, analny lub transmisję pośrednią poprzez kontakt ręczny. Nadal trudno jest rozróżnić, które zachowania seksualne są odpowiedzialne za transmisję HPV z dróg rodnych do jamy ustnej. Głębokie pocałunki i rimming (tj. kontakt ustno-analny) również są związane z powszechnym zakażeniem HPV w jamie ustnej. Przenoszenie z ust do ust, poprzez głębokie pocałunki, pozostaje możliwym źródłem wirusów.

Udowodniono, że transmisja oralno-genitalna jest najlepiej udokumentowaną drogą doustnego zakażenia HPV. Wśród kobiet w wieku 18–69 lat, z dostępnymi danymi przesiewowymi DNA HPV jamy ustnej i pochwy, zakażenie HPV pochwy było obecne u 45,2%, jamy ustnej u 4,1%, a podwójne zakażenie u 3,0%. Posiadanie nowego partnera seksualnego było pozytywnie związane z podwójną infekcją. Prawie połowa mężczyzn w USA ma stwierdzone zakażenie HPV prącia, co ściśle korelowało z zakażeniem HPV jamy ustnej.

W przypadku uprawiania seksu tylko z jednym partnerem homoseksualnym ryzyko zakażenia hrHPV w jamie ustnej wynosiło 19,3%, jeśli partner miał infekcję narządów płciowych. Ryzyko to wzrastało do 22,2%, jeśli seks oralny był uprawiany z dwoma lub więcej partnerami homoseksualnymi. Częstość występowania HPV jamy ustnej wśród młodych heteroseksualnych mężczyzn była niższa niż w związkach homoseksualnych, jednak wzrastała ona w przypadku większej liczby partnerów (17,9%), uprawiających seks oralny (28,6%) oraz partnerów z zakażeniem jamy ustnej lub narządów płciowych (11,5%). Ponadto częstość występowania HPV jamy ustnej wzrastała wśród mężczyzn, których partner miał infekcję narządów płciowych tym samym typem HPV, dając dowody na to, że ustny HPV może być przenoszony drogą oralno-oralną lub oralno-genitalną.

Pary, w których jeden z partnerów ma udokumentowaną infekcję HPV są szczególnie zgodne w zakresie typów HPV. Mężowie kobiet z rakiem szyjki macicy mieli podwyższony standaryzowany współczynnik zachorowalności na rozwój raka migdałków lub języka, wynoszący 2,7:1, natomiast u mężów kobiet ze śródnabłonkową neoplazją szyjki macicy stosunek ten wynosił 2,4:1,52. Jednak ryzyko transmisji HPV między pacjentkami z rakiem jamy ustnej a ich partnerami seksualnymi wykazuje rozbieżne wyniki; DNA HPV16 w jamie ustnej wykryto u pacjentów z tym nowotworem w chwili rozpoznania, ale nie u ich partnerów.

Oczywiście abstynencja seksualna jest najbardziej niezawodną metodą ochrony przed HPV, ale nie może być uważana za panaceum na zapobieganie HPV i wszystkim innym infekcjom przenoszonym drogą płciową. Dlatego najważniejszym zaleceniem jest ostrożne podejście do praktyk seksualnych. Mała liczba partnerów seksualnych w życiu oraz konsekwentne i prawidłowe stosowanie prezerwatyw, choć nie zapewnia pełnej ochrony, może zmniejszyć narażenie na HPV.

Patologia

Papillomawirusy powodują zmiany kliniczne na skórze oraz błonach śluzowych. W obrębie każdej z tych lokalizacji poszczególne HPV określane są jako typy wysokiego lub niskiego ryzyka w zależności od skłonności do złośliwego postępu zmian. Większość HPV to wirusy niskiego ryzyka, które lokalnie wytwarzają brodawki nie ulegające progresji złośliwej nawet jeśli nie są leczone i często ustępujące samoistnie w ciągu kilku lat. Jednak niektóre typy HPV są związane z rozwojem nowotworów (Tabela 1).

Tabela 1. Zmiany kliniczne błon śluzowych zależne od typów HPV (czerwoną czcionką zaznaczono HPV wysokiego ryzyka).

Długi odstęp między zakażeniem HPV a rozwojem nowotworu oznacza, że oprócz przetrwałej infekcji odpowiednim typem wirusa, do progresji złośliwości przyczyniają się dodatkowe czynniki środowiskowe i/lub gospodarza. Status immunologiczny jest jednym z ważnych parametrów gospodarza, a upośledzona funkcja odpowiedzi komórkowej wiąże się z większym ryzykiem przetrwałej infekcji i raka. Doniesiono, że u dorosłych pacjentów z niedokrwistością Fanconiego, dziedziczną chorobą polegającą na wadliwej naprawie DNA, występuje ponad 100-krotnie zwiększone ryzyko rozwoju nowotworów związanych z HPV. Egzogenna ekspozycja zmian wywołanych przez papillomawirusy na dodatkowe karcynogeny może stanowić mechanizm środowiskowy. Na przykład większość nowotworów skóry w Epidermodysplasia Verruciformis (EV) występuje na skórze wystawionej na działanie promieni słonecznych, co oznacza, że światło UV służy jako dodatkowy czynnik ryzyka. W kilku badaniach wykazano, że czynniki związane ze stylem życia mogą znacznie zwiększyć prawdopodobieństwo rozwoju przetrwałej infekcji. Na przykład, zarówno palenie, jak i spożywanie alkoholu są istotnymi czynnikami ryzyka trwałego zakażenia HPV jamy ustnej i narządów płciowych. Sugeruje się, że substancje rakotwórcze w dymie papierosowym zwiększają miano wirusa, a także prawdopodobieństwo transformacji nowotworowej komórek nabłonka zakażonych HPV.

Rak szyjki macicy

W połowie lat 70. XX wieku Meisels i Fortin stwierdzili na podstawie badań morfologicznych, że zakażenie szyjki macicy wirusem HPV występowało często, wraz z histologiczną charakterystyką łagodnego CIN. Obserwacje te zbiegły się z propozycją zur Hausena, że infekcja HPV może być przypuszczalnym czynnikiem przenoszonym drogą płciową odpowiedzialnym za powstawanie raka szyjki macicy. Wykrycie w tym okresie HPV-5 i HPV-8 w raku skóry u pacjentów z Epidermodysplasia Verruciformis (EV) silnie sugerowało, że niektóre typy HPV mogą mieć potencjał onkogenny.

Ponad 50 typów HPV, głównie z rodzaju Alfa, zakaża drogi płciowe. Jednak tylko kilkanaście z nich występuje regularnie w raku szyjki macicy i w znacznie większym odsetku niż w grupie kontrolnej, co pozwoliło na określenie tych typów jako HPV „wysokiego ryzyka” (high risk HPV, hrHPV). Z kolei typy HPV, które są stosunkowo często wykrywane w grupie kontrolnej, ale rzadko w nowotworach, są określane jako HPV „niskiego ryzyka” (low risk HPV, lrHPV). We wszystkich regionach świata HPV-16 jest najczęstszą przyczyną nowotworu szyjki macicy.

W skali świata, rak szyjki macicy jest czwartym najczęściej występującym nowotworem złośliwym wśród kobiet, z szacunkową liczbą 604 000 przypadków i 342 000 zgonów w 2020 r. (WHO). Pomimo ogólnoświatowego rozpowszechnienia, częstość i lokalizacja występowania raka szyjki macicy jest bardzo zróżnicowana i jest około 10 razy częstsza w niektórych krajach rozwijających się niż w większości krajów uprzemysłowionych; ponad 85% przypadków raka szyjki macicy występuje w krajach rozwijających się, stanowiąc aż jedną czwartą przypadków nowotworów u kobiet.

Rak szyjki macicy jest zdecydowanie najczęstszą chorobą związaną z HPV. Około 99,9% przypadków tego nowotworu jest spowodowanych uporczywym zakażeniem HPV wysokiego ryzyka, chociaż w nielicznych przypadkach w tkance nowotworowej wykrywano także HPV niskiego ryzyka.

Szyjka macicy jest pokryta błoną śluzową, którą budują dwa rodzaje nabłonka; nabłonek wielowarstwowy płaski i jednowarstwowy nabłonek kolumnowy (walcowaty, gruczołowy). Tarcza szyjki macicy w większości jest pokryta nabłonkiem wielowarstwowym płaskim, zaś kanał wyściela nabłonek kolumnowy. Granica pomiędzy tymi typami nabłonka nosi nazwę strefy T (transformacji, metaplastycznej), w której dochodzi do wzajemnego przerastania nabłonków płaskiego i walcowatego (Ryc. 3). Lokalizacja strefy T zmienia się wraz z wiekiem kobiety; przed dojrzewaniem znajduje się ona na granicy ujścia kanału i tarczy szyjki macicy, później przesuwa się na tarczę, a u kobiet starszych cofa się do kanału szyjki macicy. Ma to istotne znaczenie podczas pobierania wymazów do cytologii oraz wyboru sposobu leczenia w razie rozpoznania nowotworu.

Rycina 3. Anatomia układu rozrodczego kobiety z uwzględnieniem budowy błony śluzowej szyjki macicy. (A.Szuster-Ciesielska, BioRender.com).

Ponad 90% nowotworów szyjki macicy powstaje w strefie transformacji, czyli w rejonie, gdzie zachodzą ciągłe zmiany metaplastyczne. Okres największej aktywności tych zmian zbiega się z największym ryzykiem zakażenia HPV i występuje w okresie dojrzewania i pierwszej ciąży, a następnie powoli maleje po wystąpieniu menopauzy. Około 85% przypadków raka szyjki macicy to rak płaskonabłonkowy. Większość innych przypadków to gruczolakoraki, a niewielka liczba to drobnokomórkowe guzy neuroendokrynne.

Aby ostatecznie rozwinął się rak płaskonabłonkowy, zakażone hrHPV komórki nabłonkowe szyjki macicy zwykle przechodzą przez wiele lat szereg zmian dysplastycznych. Nasilenie zmian zależy od stopnia, w jakim nabłonek płaski jest zastępowany przez komórki podstawnokomórkowe (bazaloidalne), przy czym w najcięższych przypadkach dysplazji dochodzi do wymiany całej grubości nabłonka płaskiego. Zmiany, dawniej określane jako dysplazja i rak przedinwazyjny, dzisiaj bardziej szczegółowo opisuje się akronimami CIN i SIL. W histologicznej klasyfikacji śródnabłonkowej dysplazji szyjki macicy (cervical intraepithelial dysplasia, CIN) stopnie CIN 1, 2 i 3 odpowiadają odpowiednio łagodnej dysplazji, umiarkowanej dysplazji i ciężkiej dysplazji lub rakowi in situ (Ryc. 4 i 5). Stopień dysplazji można oceniać poprzez ilość i wygląd złuszczonych komórkach obecnych w rozmazie Papanicolaou (Pap smear), przy czym obecność koilocytów stanowi dowód zakażenia HPV, zaś komórek bazaloidalnych jest dowodem dysplazji. Z kolei w binarnym systemie cytologicznym Bethesda nieprawidłowości są klasyfikowane jako śródnabłonkowe zmiany płaskonabłonkowe o niskim (low grade) lub wysokim (high grade) stopniu złośliwości (squamous intraepithelial lesions, SIL); niski stopień (LSIL) odpowiada łagodnym nieprawidłowościom cytologicznym, a wysoki stopień (HSIL) obejmuje nieprawidłowości poważniejsze. CIN1 i niski stopień SIL są obecnie uważane za objawy produktywnej infekcji HPV. Klasyfikacja Bethesda wyróżnia także nietypową cytologię płaskonabłonkową o nieokreślonym znaczeniu (atypical squamous cytology of undetermined significance, ASCUS) w przypadku niejednoznacznych zmian cytologicznych; tutaj ryzyko progresji HPV-dodatnich zmian ASCUS do HSIL jest równe ryzyku przejścia do LSIL.

Rycina 4. Zmiany histologiczne, cytologiczne i wirusologiczne podczas progresji od początkowej infekcji do raka szyjki macicy. CIN – śródnabłonkowa neoplazja szyjki macicy; LSIL – śródnabłonkowa neoplazja płaskonabłonkowa niskiego stopnia; HSIL – śródnabłonkowa neoplazja szyjki macicy wysokiego stopnia. (A.Szuster-Ciesielska, BioRender.com).
Rycina 5. Zmiany histologiczne podczas progresji od początkowej infekcji do raka szyjki macicy. CIN – śródnabłonkowa neoplazja szyjki macicy. (Źródło http://togcentre.blogspot.com/2018/06/cervical-cancer.html)

Większość dysplazji ustępuje samoistnie, ale prawdopodobieństwo ich cofnięcia maleje wraz z ciężkością zmian (Ryc. 6). Ciężkie dysplazje (określane również jako stany przedrakowe) na ogół powstają po kilku latach z mniej zaawansowanych zmian, chociaż niektóre CIN3 mogą rozwijać się szybko, bez przechodzenia przez stadium niskiego stopnia, co może wynikać zarówno z powodu zakażenia wirusem hrHPV, jak również z wyjątkowej podatności komórek strefy transformacji. Ze względu na długi okres między rozwojem dysplazji szyjki macicy a rakiem inwazyjnym, obserwacja nieprawidłowości w badaniu cytologicznym lub dodatnie wyniki w badaniach przesiewowych opartych na wykrywaniu dna HPV może zidentyfikować większość zmian przednowotworowych. Właściwa obserwacja kobiet z tymi nieprawidłowościami wraz z odpowiednim leczeniem, może zapobiec rozwojowi większości przypadków raka szyjki macicy. Jednak w niektórych krajach, w których istnieją programy badań przesiewowych, częstość występowania gruczolakoraka i raka gruczolakokomórkowego wzrasta, co sugeruje, że badanie cytologiczne było mniej skuteczne w identyfikacji prekursorów tych typów nowotworów.
Rycina 6. Scenariusz zdarzeń po infekcji HPV – progresja do raka szyjki macicy. Im szersza strzałka tym większe prawdopodobieństwo zdarzenia. (A.Szuster-Ciesielska, BioRender.com).

W ogólnoświatowej metaanalizie, której wyniki opublikowano w 2007 roku, w 14 595 raków szyjki macicy, z których 89,7% było HPV-dodatnich, HPV-16 i HPV-18 wykryto w 70% przypadków, podczas gdy częstość występowania każdego innego typu nie przekraczała więcej niż 4,4%. (Ryc. 7A). Z kolei modelowanie prawdopodobieństwa udziału różnych hrHPV w dysplazji >CIN2 przeprowadzone w roku 2019 wykazało, że chociaż HPV-16 wciąż pozostaje dominującym typem, to w częstości pojawiania się dysplazji możliwy jest większy udział takich hrHPV jak HPV-31, -33 i -58 (Ryc. 7B). Powyższe wyniki analizy ryzyka zostały potwierdzone w tym samym roku w Danii, gdzie wykazano bezwzględne ryzyko progresji przetrwałego zakażenia HPV-16 do CIN3 na poziomie 55%, zaś kolejnymi najbardziej zjadliwymi typami okazały się być HPV-33, -18 i -31 z bezwzględnym ryzykiem odpowiednio 33%, 32% i 31%.      

Rycina 7. Udział poszczególnych typów HPV w powstawaniu nowotworów (A) lub dysplazji >CIN2 (B). (A) na podstawie Human papillomavirus type distribution in invasive cervical cancer and high-grade cervical lesions: a meta-analysis update. I Smith JS, Lindsay L, Hoots B, et al. nt J Cancer 2007;121:621–632.). (B) na podstawie Bayesian analysis of baseline risk of CIN2 and ≥CIN3 by HPV genotype in a European referral cohort. Bonde et al. Int. J. Cancer. 2019, 145, 1033–1041

W postępowaniu diagnostycznym, wykorzystuje się badanie cytologiczne oraz kolposkopię:

  • Diagnostyka cytologiczna to metoda opierająca się na cytologii złuszczeniowej nabłonków, którą datuje się od 1943 roku, tj. od chwili opublikowania monografii przez Papanicolaou i Trauta. Próbkę do badania pobiera się szczoteczką z tarczy części pochwowej oraz z kanału szyjki macicy. Pobrany rozmaz ze złuszczonymi komórkami jest następnie utrwalany i wybarwiany. Zgodnie z klasyfikacją cytologiczną wg systemu Bethesda i jego modyfikacją z 2001 roku nieprawidłowości komórek nabłonka płaskiego odpowiadające stanom przedrakowym dzieli się na zmiany śródnabłonkowe małego stopnia (LSIL) oraz zmiany śródnabłonkowe dużego stopnia (HSIL). Z kolei zgodnie z klasyfikacją WHO wewnątrznabłonkowa neoplazja szyjki macicy to zmiany ograniczone do nabłonka, z których potencjalnie może rozwinąć się płaskonabłonkowy rak inwazyjny i które precyzyjnie opisuje się akronimem CIN z podziałem na CIN1 (dysplazja małego stopnia, łagodna), CIN2 (dysplazja średniego stopnia, umiarkowana) oraz CIN3 (dysplazja dużego stopnia, ciężka) (Ryc. 8).
  • Diagnostyka kolposkopowa (z grec. kolpos – pochwa, skopein – zaglądać, podglądać) wykonywana jest z użyciem urządzenia optycznego zwanego kolposkopem i służy do badania szyjki macicy, pochwy i sromu. Po raz pierwszy metodę tę opisał Hans Hinselmen w 1925 roku jako narzędzie w przesiewowym badaniu raka szyjki macicy. Jest to procedura diagnostyczna przeprowadzana w celu oceny kobiet z nieprawidłowym wynikiem testu Papanicolaou, z dodatnim wynikiem DNA wirusa hrHPV lub z podejrzanie wyglądającą szyjką macicy, nawet jeśli wynik testu PAP jest w normie. Wykonywany jest również jako kontrola po leczeniu śródnabłonkowego i inwazyjnego. Chociaż kolposkopia uważana jest za metodę uzupełniającą w stosunku do diagnostyki cytologicznej, to powinna ona być integralną częścią badania ginekologicznego. 
Rycina 8. Schemat postępowania profilaktycznego raka szyjki macicy w Polsce. (A.Szuster-Ciesielska, BioRender.com).

W Polsce ro roku umiera z powodu raka szyjki macicy ponad 1 300 kobiet, a u ponad 10 tys. stwierdza się zmiany przednowotworowe (Ryc. 9).

Rycina 9. Epidemiologia HPV-zależnych nowotworów w Polsce (2020). (A.Szuster-Ciesielska, BioRender.com).

W latach 2006/2007 wprowadzono po raz pierwszy szczepienia przeciwko HPV. Najnowsza obecnie szczepionka Gardasil 9 pokrywa 90% wszystkich typów HPV powodujących raka szyjki macicy, a dodatkowo chroni przed HPV niskiego ryzyka typu 6 i 11. Szczepionka zawiera cząstki wirusopodobne (virus-like particles, VLP) pozbawione materiału genetycznego wirusa, a zatem po podaniu szczepionki nie jest możliwe jego odtworzenia. Działanie szczepionki zostało przedstawione na poniższej rycinie – efektem jest wytworzenie przeciwciał, które neutralizują wirusa docierającego do organizmu, oraz pamięci immunologicznej (Ryc. 10).

Rycina 10. Zasada działania szczepionki przeciw HPV – wytworzenie przeciwciał neutralizujących wirusa oraz pamięci immunologicznej. (A.Szuster-Ciesielska, BioRender.com).

Jej wysoką skuteczność w ochronie przed wczesnymi i późnymi zmianami dysplastycznymi będącymi wstępem do rozwoju raka szyjki macicy została udowodniona zarówno w badaniach klinicznych (Ryc. 11), jak i tzw. real world (Ryc. 12).

Rycina 11. Wysoka skuteczność szczepionek przeciwko HPV potwierdzona badaniami klinicznymi. (A.Szuster-Ciesielska, BioRender.com).
Rycina 12. Wysoka skuteczność szczepionek przeciw HPV potwierdzona w badaniach obserwacyjnych (real world data) (A.Szuster-Ciesielska, BioRender.com).

Należy pamiętać, że wiele innych patologicznych zmian jest powodowanych przez wirusy brodawczakowe (Tabela 1), stąd warto skorzystać z tej formy profilaktyki. Chociaż szczepienia są zalecane dla nastolatków w wieku 11-12 lat obu płci, to w roku 2018 Food and Drug Administration (FDA, USA) poszerzyła granice wiekowe do zalecania szczepień przeciw HPV dla mężczyzn i kobiet do lat 45.

Piśmiennictwo

  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3317948/
  2. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/rmv.2337#
  3. https://bmcinfectdis.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12879-018-3645-0
  4. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6617734/
  5. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK441884/
  6. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC145302/
  7. https://www.cancer.org/cancer/types/cervical-cancer/causes-risks-prevention/risk-factors.html
  8. https://www.hindawi.com/journals/jo/2019/3257939/?utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=HDW_MRKT_GBL_SUB_ADWO_PAI_DYNA_JOUR_X_PJ_GROUP3&gclid=Cj0KCQjwuZGnBhD1ARIsACxbAVhG5BwN6eZTv2nbETVsfp2TItiH0UHFUCJtuLQAGTg5cS_bFHA5vf8aAhD8EALw_wcB
  9. https://www.thelancet.com/clinical/diseases/hpv-and-cervical-cancer
  10. https://bmcinfectdis.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12879-018-3645-0

Czy istnieją infekcyjne przyczyny otyłości?

Otyłość to pandemia XXI wielu. Dane są bardzo niepokojące – 13% dorosłych na świecie jest otyłych, a 39% ma nadwagę. Nadwagę ma także jedno na pięcioro dzieci i nastolatków. Otyłość odpowiada za co najmniej 2,8 mln przedwczesnych zgonów rocznie i jest wiodącym czynnikiem ryzyka śmierci zaraz po wysokim ciśnieniu, paleniu papierosów, zanieczyszczeniu powietrza i wysokim poziomie cukru (Ryc. 1). Statystyki są także niedobre dla Polski – wg. danych GUS (za rok 2022) w Polsce z problemem nadmiernej masy ciała zmaga się 62% mężczyzn i 46% kobiet, zaś co piąty Polak jest otyły. Takie dane plasują nas w pierwszej dziesiątce krajów europejskich z najwyższym odsetkiem osób z nadwagą lub otyłych (Ryc. 2).

Ryc. 1. Czynniki ryzyka zgonów na świecie [1].
Ryc. 2. Miejsce Polski na tle Europy w rankingu odsetka otyłych osób [2].

Do definiowania masy ciała służy nam wskaźnik BMI (Body Mass Index). Jest to parametr opracowany w 1832 roku przez belgijskiego statystyka Adolfa Queteleta, który zajmował się analizą zależności pomiędzy wzrostem i wagą ciała człowieka. To pozwoliło na wdrożenie indeksów prawidłowej i nieprawidłowej masy ciała (Ryc. 3).

Proponuję, aby od razu sprawdzić swoje BMI. Jest to bardzo proste, a potrzebne są tylko takie dane, jak wzrost i aktualna masa ciała. Następnie należy podzielić wagę wyrażoną w kilogramach przez wzrost podniesiony do kwadratu, wyrażony w metrach, czyli w skrócie BMI = kg/m2. Jeśli nie chcesz robić tego samodzielnie, można skorzystać z gotowych, internetowych kalkulatorów. Wiele z nich uwzględnia przy obliczaniu BMI także płeć, dzięki czemu wyniki są bardziej miarodajne.

Ryc. 3. Body mass index [opracowanie własne, created with BioRender. com].

Wydaje się, że na dramatyczny wzrost liczby osób otyłych na świecie mają wpływ czynniki zewnętrzne niezależne od nawyków żywieniowych, ćwiczeń fizycznych czy cech genetycznych. Jedna z hipotez mówi o czynnikach infekcyjnych powodujących efekt epidemii otyłości, jak ma to miejsce w przypadku chorób zakaźnych. Powszechnie wiadomo, że zakażenie niektórymi patogenami powoduje dysfunkcje metaboliczne, takie jak otyłość i cukrzyca. Spośród ludzkich wirusów związanych z otyłością najczęściej wymienia się adenowirusa 36 (Ad36) (Ryc. 4).

Ryc. 4. Adenowirus – zdjęcie z mikroskopu elektronowego [4].

Adenowirusy są powszechnymi patogenami ludzi i zwierząt, transmitowanymi głównie drogą oddechową, ale też w wyniku bezpośredniego kontaktu oraz drogą fekalno-oralną. Wykryto je w roku 1953 w tkance adenoidalnej (chłonnej gardła), stąd nazwa całej rodziny – Adenoviridae. Zidentyfikowano ponad 100 różnych serologicznie typów adenowirusów, w tym 49 typów infekujących ludzi. Kilka gatunków adenowirusów jest wykorzystywanych jako narzędzia w biologii molekularnej. Odpowiedzialne są za ciągłe, utajone infekcje migdałków i węzłów chłonnych oraz innych tkanek limfoidalnych człowieka i zwierząt powodując choroby układu oddechowego, pokarmowego i oczu.

Korelacja Ad36 z otyłością jest dobrze zbadana zarówno u ludzi, jak i zwierząt. Ad36 zwiększał zawartość tłuszczu u zakażonych gryzoni i małp, u których masa ciała wzrastała trzykrotnie. Wyniki metaanalizy wykazały, że związek zakażenia Ad36 z otyłością był silniejszy u dzieci i młodzieży niż u dorosłych. Np. u dorosłych zakażenie Ad36 wiązało się z 1,7-krotnie wyższym ryzykiem rozwoju otyłości, podczas gdy u dzieci i młodzieży ryzyko to oscylowało już w granicach 2,3-2,6. Obserwacje te wskazują na możliwość przesiewowego badania Ad36 u osób podatnych na otyłość (np. przeciwciał przeciw Ad36). Co więcej, zrozumienie mechanizmów molekularnych otyłości, w której pośredniczy Ad36, może pomóc w opracowaniu sposobów leczenia i/lub kontrolowania otyłości związanej z wirusami.

Podatność na zakażenie Ad36 i rozwój otyłości różniła się w zależności od narodowości. Częstość występowania infekcji Ad36 u osób otyłych w porównaniu do osób z prawidłową wagą była:

  • 3-krotnie większa w USA (tutaj też 2,6-krotnie wyższa u Afroamerykanów niż osób rasy kaukaskiej).
  • 2-krotnie większa w Korei, Włoszech i Szwecji
  • 4-krotnie większa w Turcji
  • w Holandii i Belgii nie odnotowano różnic.

Jak to się dzieje, że Ad36 sprzyja otyłości?

Tkanka tłuszczowa zbudowana jest z komórek tłuszczowych – adipocytów. Jej powiększanie związane jest z hiperplazją lub hipertrofią. Hiperplazja polega na zwiększeniu liczby komórek, za którą nie idzie jednak indukcja stanu zapalnego (to dobrze). Z kolei hipertrofia polega na zwiększaniu objętości komórek, co jest bardziej zdrowotnie niekorzystne ze względu na inicjację stanu zapalnego (proszę zwrócić uwagę na większą liczbę makrofagów w takiej tkance na Ryc. 5) oraz zmniejszeniem wrażliwości na insulinę (ta insulinooporność może doprowadzić do rozwoju cukrzycy typu 2).

Ryc. 5. Porównanie hipertrofii i hiperplazji komórek tłuszczowych (adipocytów) [5].

Ad36 powoduje obydwa te zjawiska (wykazano to w badaniach zarówno na hodowlach komórkowych, jak i u zwierząt). Ponadto infekcja tym wirusem zwiększa magazynowanie tłuszczu (lipidów) w adipocytach (Ryc. 6).

Ryc. 6. Barwienie BODIPY pokazujące akumulację lipidów w hASC (human adipose-derived stem cell line). Na górze pokazane są komórki kontrolne (nie zakażone wirusem), na dole – zakażone Ad36. Komórki barwiono specyficznym dla lipidów zielonym barwnikiem fluorescencyjnym BODIPY w dniach 5, 7 i 9 po podaniu wirusa. Widoczna rosnąca akumulacja lipidów w czasie w komórkach zakażonych Ad36 (na co wskazuje wzrastająca zielona fluorescencja). Komórki niezakażone nie wykazują zmian w akumulacji lipidów w czasie [6].

Wiadomo, że otyłość wiąże się z pogorszeniem kontroli glikemii (cukru) oraz zwiększeniem ilości lipidów krążących oraz wątrobowych. Przy otyłości powodowanej przez Ad36 ciekawe jest, że chociaż rośnie udział tkanki tłuszczowej w masie ciała, to u tych osób paradoksalnie nie odnotowuje się we krwi wyższego poziomu trójglicerydów i cholesterolu. Co więcej, obecność Ad36 promuje usuwanie glukozy z narządów w celu poprawy kontroli glikemii.

Czy przy otyłości związanej z zakażenie Ad36 może pomóc aktywność fizyczna? Badania wykonane z udziałem otyłych myszy niestety nie wykazały, aby ćwiczenia pomagały zmniejszyć otyłość i masę podskórnej warstwy tłuszczu. Ale jest też dobra wiadomość – ćwiczenie zdecydowanie poprawiły profil cukrowy (glikemia).

Czy zakażenie Ad36 prowadzące do otyłości może wywierać wpływ na geny? Tak. Wykazano, że po zakażeniu wirusem Ad36 aktywacji ulega aż 36 genów zaangażowanych w adipogenezę (powstawanie komórek tłuszczowych), ale także innych genów, np. uczestniczących w hamowaniu funkcji mitochondriów (to centra energetyczne komórki) oraz genów odpowiedzialnych za progresję stresu oksydacyjnego (on sam w sobie jest szkodliwy dla komórek).

Jak wygląda odpowiedź odpornościowa u otyłych osób zakażonych Ad36?

Nadmierna tkanka tłuszczowa sama w sobie jest terenem rozwoju przewlekłych reakcji zapalnych. Wydzielane przez adipocyty cytokiny zapalne zwabiają tu komórki odpornościowe, jak makrofagi – stąd ich zawartość w tej tkance znacząco wzrasta. Na przykład u szczupłych osób odsetek makrofagów w tkance tłuszczowej stanowi 10%, podczas gdy u otyłych – nawet 40%. Ale … ważna jest także populacja makrofagów. Wyróżnia się makrofagi M1 o aktywności prozapalnej i M2 o aktywności przeciwzapalnej. I właśnie w tkance tłuszczowej osób otyłych istnieje przewaga tych prozapalnych makrofagów (już pomijając większą ich liczbę) (Ryc. 5).

Nieco inaczej wygląda to po zakażeniu Ad36 – początkowo rzeczywiście obserwuje się wzrost liczebności prozapalnych M1 odpowiadający ostremu stanowi zapalnemu, ale w miarę upływu czasu do głosu dochodzą M2, które ten stan zapalny zaczynają osłabiać, ale nie likwidować.

Podsumowanie:

  • Chociaż badania ujawniły rolę Ad36 w wywoływaniu otyłości to wciąż brakuje wielu powiązań między zakażeniem Ad36 a otyłością, ze względu na nałożenie się bezpośredniego działania wirusa i skutków odpowiedzi gospodarza.
  • Zakażenie Ad36 powoduje zwiększenie liczby i objętości komórek tłuszczowych oraz magazynowanie w nich lipidów (tłuszczów).
  • Infekcja Ad36 wywołuje ostre i przewlekłe zapalenie, co przyczynia się do angiogenezy (powstawanie naczyń krwionośnych) w tkance tłuszczowej. To sprzyja wychwytowi glukozy z krwi przez co jej poziom pozostaje prawidłowy – przeciwnie, niż gdy powodem otyłości jest nieprawidłowa dieta.
  • Chociaż otyłość jest wieloprzyczynowa (geny, brak aktywności fizycznej, niewłaściwa dieta) to warto się zastanowić nad możliwością przesiewowego badania Ad36 u osób podatnych na otyłość.
  • Dalsza identyfikacja bezpośrednich i pośrednich czynników wpływających na otyłość wywołaną przez Ad36 może dostarczyć nowych informacji na jej temat i opracowania nowych leków na choroby związane z otyłością, takie jak insulinooporność i NAFLD (niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby).
  • Obecnie nie ma sposobu leczenia otyłości wywołanej przez Ad36 i chociaż udowodniono, że szczepionka jest wykonalna, to dotychczas jej nie opracowano.

Źródła:

1.       https://ourworldindata.org/obesity

2.       https://www.ciekawestatystyki.pl/2021/07/otyosc-w-polsce-i-na-tle-europy.html

3.       „Viruses as an etiology of obesity, 2007, https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17908526/

4.       Zdjęcie – Wikipedia1

5.       „Adipose Tissue Remodeling: Its Role in Energy Metabolism and Metabolic Disorders” Frontiers in Endocrinology 2016 https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fendo.2016.00030/full.

6.       „Human adenovirus Ad-36 induces adipogenesis via its E4 orf-1 gene” International Journal of Obesity 2007, https://www.nature.com/articles/0803748

7.       „What we know and what we need to know about adenovirus 36-induced obesity”, International Journal of Obesity 2020 r. https://www.nature.com/articles/s41366-020-0536-4

8.       „Adenovirus-36 as one of the causes of obesity: the review of the pathophysiology”, Nutrition Research 2021. https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0271531720305868