Agnieszka Szuster-Ciesielska – pracuję naukowo i wykładam. Obszary zainteresowań i popularyzacji wiedzy to wirusologia, immunologia i wakcynologia. Punktuję antynaukę. TT: @AgnieszkaSzust3, FB: Prof. Agnieszka Szuster-Ciesielska.
Kilka dni po tym, jak pozostali przy życiu żołnierze obdartej 6. armii niemieckiej poddali się w wielomiesięcznej, krwawej ofensywie na Stalingrad w lutym 1943 roku, przyznając się do porażki nazistowskiego projektu imperialnego w Europie Wschodniej, żydowski naukowiec Ludwik Fleck (Ryc. 1) wraz z rodziną i kilkoma kolegami zostali wsadzeni do pociągu pasażerskiego we Lwowie w okupowanej Polsce i przewiezieni do Auschwitz. W księdze zapisano przyjęcie Flecka: numer więźnia 100967.
Ryc. 1. Doktor Ludwik Fleck [1].
W rzeczywistości ten nowy więzień obozu nie był tak anonimowy jak sugerował wpis w księdze. Niemcy byli pod presją nie tylko ostrzału wroga i brutalnej rosyjskiej zimy, ale także chorób zakaźnych. Fleck, mikrobiolog, któremu w 1942 r. udało się zaprojektować nową szczepionkę przeciw tyfusowi w słabo wyposażonym laboratorium w nędznych warunkach lwowskiego getta, miał zostać wykorzystany przez nazistowskie dowództwo.
Tyfus, choroba przenoszona przez wszy (Ryc. 2) a wywoływana przez bakterię Rickettsia prowazekii, nie bez powodu był źródłem zmartwień w czasie wojny. Wszy rozprzestrzeniały się i mnożyły szczególnie skutecznie przy przeludnieniu i braku higieny, czyli w warunkach jakie zwykle występowały podczas zawieruch wojennych (okopy, obozy), a tyfus najbardziej dotykał organizmy osłabione stresem i niedożywieniem. Objawy obejmowały wysoką gorączkę i wysypkę, ból i psychozę. W okopach wojennych i obozach prześladowanych (Ryc. 3) często wybuchały ogniska choroby, a każdy wybuch choroby powodował śmierć 5-40% chorych. A teraz trochę historii …
Ryc. 2. Wesz przenosząca bakterię Rickettsia prowazekii jako przyczynę tyfusu. [Wikidoc, domena publiczna]Ryc. 3. Więzień obozu w Bergen-Belsen, kwiecień 1945 [domena publiczna]
Podczas II wojny światowej wielu pamiętało ostatnią wielką epidemię tyfusu, gdy linię frontu I wojny światowej nękały infekcje – w samym 1915 r. na tyfus zmarło około 150 000 serbskich żołnierzy. W latach 1918–1922 tyfus rozprzestrzenił się po Rosji i Polsce, zakażając około 30–40 milionów, zabijając może trzy miliony.
Jednak od tego czasu kilku pomysłowych naukowców podjęło wyzwanie związane z tyfusem – było to znaczące wyzwanie, ponieważ hodowla Rickettsia prowazekii w laboratorium była wyjątkowo trudna.
W latach 20. XX wieku lwowski zoolog, dr Rudolf Weigl (Ryc. 4), opracował doodbytniczy sposób szczepienia wszy bakterią tyfusu. Dzięki temu był w stanie pozyskać wystarczającą ilość bakterii, które wykorzystał do produkcji pierwszej szczepionki przeciw tyfusowi. W 1928 roku dwóch naukowców z Instytutu Pasteura w Tunisie z sukcesem przetestowało szczepionkę Weigla na ludziach.
Ryc. 4. Prof. Rudolf Weigl [Wikipedia, domena publiczna].
W latach 30. XX wieku wzrosło zainteresowanie nauki szczepionką przeciw tyfusowi. Pod koniec tej dekady Amerykanin Harald Cox odkrył metodę zaszczepiania woreczka żółtkowego jaj kurzych bakterią tyfusu w celu wytworzenia antygenu, a z niego szczepionki. W 1940 roku francuski naukowiec Paul Giroud wraz ze współpracownikami Michelem Durandem i polską badaczką Heleną Sparrow (Ryc. 5) współpracowali przy stworzeniu szczepionki hodowanej w płucach małych ssaków z obniżoną odpornością, która w ciągu kilku lat miała wejść do produkcji na dużą skalę w Vichy we Francji.
Ryc. 5. Helena Sparrow [Wikipedia, domena publiczna].
W 1942 r. dr Ludwik Fleck, który jeszcze w 1919 r. dołączył do laboratorium Weigla jako jego asystent, opracował radykalnie odmienne podejście do produkcji szczepionki. Jednak w tym czasie Lwów był pod okupacją hitlerowską, a Fleck był więźniem otoczonego murem getta żydowskiego. Tyfus szalał, zakażając prawie 100% ludności getta i zabijając 30%. Zapasy medyczne się skończyły.
W takich warunkach nie było możliwości stworzenia funkcjonalnego laboratorium wszy w stylu Weigla. Jednak przy tak dużej liczbie zakażonych Fleck zaczął szukać antygenu tyfusu w moczu chorych. Znalazł go, opracowując najpierw metodę diagnostyczną, a następnie szczepionkę. W sierpniu 1942 roku był gotowy do przetestowania szczepionki na sobie samym. Ostatecznie około 500 więźniów getta otrzymało szczepionkę Flecka.
Wieść o szczepionce Flecka szybko się rozeszła. Wkrótce naukowcowi nakazano zgłosić się do miejscowej siedziby Gestapo ze swoimi projektami eksperymentalnymi. Umundurowani lekarze specjaliści „spisali wszystko, powtarzali pytania” – powiedział Fleck. Niektóre pytania nie były zbyt inteligentne. Na przykład pytali, czy szczepionka będzie skuteczna dla Aryjczyków. Odpowiedziałem: „Oczywiście, ale musi być zrobiona z moczu aryjskiego, a nie żydowskiego”.
Uwaga Flecka była oczywiście sarkastyczna – była krytyką pseudonauki mającej obsesję na punkcie rasy, która charakteryzowała nazistowskie podejście do zdrowia publicznego. „Ideologia nazistowska zidentyfikowała tyfus… jako chorobę charakterystyczną dla pasożytniczych podludzi – Żydów”. Ale na początku wojny Niemcy pozostawały w tyle za swoimi sąsiadami w badaniach nad tyfusem.
Jednak niezależnie od błędnej logiki rządzącej nazistowskim establishmentem służby zdrowia, w 1942 r. tyfus stał się palącym zagrożeniem dla losów Niemiec – bardziej realnym niż wyimaginowane widmo żydowskiego skażenia społeczno-patologicznego. W tym samym roku zgłoszono 40 000 przypadków tyfusu wśród wycofujących się żołnierzy niemieckich na froncie wschodnim. Ponad 10% z nich zmarło. Instytut Badań nad Tyfusem Plamistym i Wirusami we Lwowie został zaangażowany do produkcji szczepionek dla Wehrmachtu, podobnie jak Instytut o tej samej nazwie w Krakowie. Wyprodukowanie szczepionki było jednak logistycznym koszmarem, a armia niemiecka potrzebowała więcej dawek niż Lwów i Kraków były w stanie wysłać.
Gdy Fleck i jego koledzy z laboratorium przybyli do Auschwitz, Joachim Mrugowsky (Ryc. 6), szef Instytutu Higieny SS w Berlinie, pracował nad planem budowy nowego centrum produkcji szczepionek przeciw tyfusowi w obozie koncentracyjnym Buchenwald niedaleko Weimaru.
Ryc. 6. Joachim Mrugowsky, szef Instytutu Higieny SS w Berlinie [Wikipedia, domena publiczna].
W sierpniu 1943 roku placówkę otwarto w bloku 50 (Ryc. 7), masywnym, trzypiętrowym budynku. Kierowane przez karierowicza lekarza SS, Erwina Ding-Schulera (Ryc. 8) laboratorium zatrudniało więźniów. Większość więźniów w zespole stanowili naukowcy i lekarze, ale żaden z nich nie był immunologiem. I nikt nie miał doświadczenia w walce z Rickettsia prowazekii – dlatego nie byli w stanie wyprodukować skutecznej szczepionki z wykorzystaniem królików. W grudniu 1943 do zespołu w bloku 50 dołączono Flecka. Nawiasem mówiąc, 25 kwietnia 1945 r. Erwin Ding-Schuler został aresztowany przez żołnierzy USA, a 11 sierpnia 1945 r. popełnił samobójstwo.
Ryc. 7. Blok nr 50 w obozie koncentracyjnym Buchenwald [2]Ryc. 8. Erwin Ding-Schuler [Wikipedia, domena publiczna].
I Fleck natychmiast zobaczył to, czego nie byli w stanie dostrzec ani pozostali więźniowie, ani Ding-Schuler. Fiolki z tak zwaną „szczepionką” nie zawierały żadnego antygenu – szczepionka Block 50 była bzdurą. To, co zespół widział jako zarazki tyfusu, w rzeczywistości było białymi krwinkami królika – nieszkodliwymi i bezużytecznymi.
Koledzy naukowcy poprosili Flecka, aby nie mówił o tym Ding-Schulerowi i w tajemnicy spróbował z nimi popracować nad skuteczną szczepionką. Kiedy zespół otrzymał z Krakowa materiał z płuc zakażonej tyfusem myszy, zaczął pod kierunkiem Flecka produkować prawdziwą, bardzo skuteczną szczepionkę – ale tylko w małych ilościach.
Kontynuowali jednocześnie produkcję i wysyłkę łącznej ilości 600 litrów fałszywej szczepionki, wystarczającej do „pełnego zaszczepienia” 200 000 żołnierzy. Fleck zeznał później: „Stworzyliśmy szczepionkę, która nie działała, natomiast do kontroli wysłaliśmy właściwą, działającą próbkę. Ding-Schuler, analfabeta, nie zdawał sobie sprawy, co się dzieje”. Dobra szczepionka, której miało być tylko sześć litrów, została podana obozowym więźniom dla ochrony przed chorobą. Zespół kontynuował swój szczepionkowy podstęp przez prawie półtora roku.
Nieco ponad dwa lata później Joachim Mrugowski (szef Instytutu Higieny SS w Berlinie) stanął przed sądem w Norymberdze. Przechwalał się, że szczepionka wyprodukowana w Bloku 50 jest najlepsza w Niemczech i ze zdumieniem dowiedział się po raz pierwszy, że było to niewiele więcej niż placebo.
John Snow (1813–1858) (Ryc. 1) był praktykującym anestezjologiem, który pokazał, jak organizm ludzki reaguje na różne dawki leków znieczulających oraz jak znieczulenie wpływa na fizjologię człowieka. Snow jest powszechnie znany z zaprojektowanych przez siebie inhalatorów i podawania chloroformu królowej Wiktorii podczas porodu dwójki jej dzieci. Jednak za tę pracę miał w przyszłości zapłacić życiem [1].
Ryc. 1. John Snow (1813-1858) [Wikipedia, domena publiczna].
John Snow był najstarszym dzieckiem w rodzinie robotniczej w Yorku. W wieku czternastu lat Snow na sześć lat został uczniem chirurga-aptekarza w Newcastle. Następnie przez rok pracował jako niecertyfikowany asystent aptekarza w wiejskim Durham i dwa lata w wiejskim West Yorkshire. Późnym latem 1836 roku przeszedł pieszo z Yorku do Londynu, przez Liverpool, Walię i Bath. Uczęszczał na wykłady w Hunterian School of Medicine i „chodził po oddziałach” szpitala Westminster. Uzyskał kwalifikacje chirurga, w 1838 r. aptekarza, a w 1844 r. lekarza. Mieszkał i praktykował w Londynie aż do swojej śmierci w 1858 r. [1]. Co ciekawe, Snow prowadził niezwykle zdrowy tryb życia. Już w wieku 17 lat, podczas stażu, przeszedł na wegetarianizm. Ponieważ książka, która skłoniła go do przyjęcia tej diety, podkreślała chorobotwórcze właściwości nieczystej wody, Snow do końca życia destylował własną wodę pitną. Na początku lat trzydziestych XIX wieku złożył ślubowanie propagowania wstrzemięźliwości [1].
W londyńskiej dzielnicy Soho, mała Frances Lewis po czterech dniach gwałtownej biegunki zmarła 2 września 1854 roku. Jej matka Sarah wyprała zabrudzone ubrania dziecka i wylała wodę z prania do szamba naprzeciw drzwi wejściowych. W ciągu dziesięciu dni zmarło ponad pięćset osób, z których większość mieszkała w bezpośrednim sąsiedztwie domu państwa Lewis na ulicy Broad Street [2].
Soho w XIX-wiecznym Londynie było zatłoczoną dzielnicą z kamienicami podzielonymi na tanie pokoje do wynajęcia. Prawie połowa lokalnych gospodarstw domowych odprowadzała odpady do szamb. Do lata 1858 w centrum Londynu nad Tamizą zapach ludzkich odchodów stał się tak gęsty i przytłaczający, że ten rozdział w historii miasta został zapamiętany jako „Wielki Smród”. Teoria ‘miazmy’, wyjaśniająca rozprzestrzenianie się choroby, przypisywała wybuch londyńskiej epidemii zanieczyszczeniom atmosferycznym; podatni pacjenci, jak sądzili lekarze, wchłonęli do krwi „truciznę” z cuchnącego powietrza, co spowodowało chorobę [2].
John Snow, lekarz mieszkający zaledwie kilka przecznic od rodziny Lewisów, interesował się cholerą już od wybuchu epidemii w 1832 r. i postawił hipotezę, że cholera przenosiła się z człowieka na człowieka poprzez wodę skażoną ludzkimi odchodami. Opisał to w swojej broszurze z 1849 r. „O sposobie komunikowania się cholery”, która nie została wówczas doceniona (Ryc. 2).
Ryc. 2. Broszura o cholerze autorstwa Johna Snowa z roku 1849 [2].
Dla Snowa wybuch epidemii w 1854 roku (która ostatecznie zabiła w ciągu kilku tygodni 700 osób) stał się kolejną okazją do zebrania danych. Lekarz podejrzewał jakieś zanieczyszczenie wody z często używanej pompy na Broad Street i poprosił Urząd Stanu Cywilnego o listę zgonów na cholerę, co pozwoliło nanieść je na mapę (Ryc. 3). Tak jak podejrzewał, koncentrowały się one wokół pompy wodnej. Co więcej, obserwacje Snowa poparł wielebny Henry Whitehead, który po rozmowach ze zdrowymi mieszkańcami Soho ustalił, że zaopatrywali się oni w wodę gdzie indziej [2].
Ryc. 3. Mapa Johna Snowa przedstawiająca lokalizację ofiar śmiertelnych cholery w Soho w 1854 roku [2].
Snow wywnioskował, że szambo, do którego Sarah Lewis wylała wodę z prania, przeciekało do pompy. 7 września przekazał swoje znaleziska władzom parafialnym. Nie uwierzono mu, ale ostatecznie Snow przekonał władze do zdjęcia rączki pompy. Pompa została zamknięta, a zaraza zatrzymana.
Dziś na rogu ulicy, która obecnie nazywa się Broadwick Street, tuż przed pubem John Snow, znajduje się replika czarno lakierowanej pompy bez uchwytu, symbolizująca odkrycie lekarza Johna Snowa w 1854 roku, że cholera jest przenoszona przez wodę (Ryc. 4). John Snow został też nazwany „ojcem założycielem epidemiologii”. Co więcej, Snow w swojej pracy wykorzystywał wielowarstwowe mapy z siatką miejską i naniesionymi źródłami wody oraz zgonami. Czy wobec tego można go traktować jako twórcę koncepcji Systemów Informacji Geograficznej?
Ryc. 4. Replika pompy na Broadwick Street jako upamiętnienie pionierskiego odkrycia epidemiologicznego [2].
John Snow zmarł w wieku 45 lat. Epidemiolodzy uważają, że do jego śmierci przyczyniły się wieloletnie eksperymenty ze środkami znieczulającymi, które doprowadziły do niewydolności nerek i ostatecznie do udaru.
Czy dzisiaj już nie spotyka się cholery? Niestety, cholera wciąż zagraża. W ciągu ostatniej dekady na świecie obserwuje się rosnącą liczbę zachorowań na cholerę. WHO szacuje występowanie na świecie 1,3-4 mln zakażeń oraz ponad 20 tys. zgonów rocznie. Tylko w okresie od 1 do 29 lutego 2024 r. na całym świecie zgłoszono 27 184 nowe przypadki cholery, w tym 248 nowych zgonów. Pięć krajów zgłaszających najwięcej przypadków to Afganistan (7 164), Demokratyczna Republika Konga (4 830), Zimbabwe (3 992), Zambia (3 842) i Somalia (1 537) [3] (Ryc. 5).
Ryc. 5. Rozmieszczenie geograficzne przypadków cholery zgłoszonych na całym świecie w okresie od grudnia 2023 r. do lutego 2024 r. [3].
To jeszcze na koniec przypomnę z jaką chorobą mamy do czynienia. Cholera jest ostrą chorobą biegunkową wywołaną zakażeniem bakterią Vibrio cholerae. Ludzie mogą zachorować po spożyciu żywności lub wody skażonej bakteriami cholery. Zakażenie jest często łagodne lub bezobjawowe, ale czasami może być ciężkie i zagrażać życiu (Ryc. 6). U około 1 na 10 osób chorych na cholerę wystąpią ciężkie objawy, które we wczesnych stadiach obejmują:
obfitą wodnistą biegunkę, czasami przypominającą popłuczyny ryżowe
wymioty
pragnienie
kurcze nóg
niepokój lub drażliwość
U osób chorych na ciężką cholerę może wystąpić poważne odwodnienie doprowadzające do niewydolności nerek. Nieleczone u tych chorych odwodnienie może prowadzić do wstrząsu, śpiączki i śmierci w ciągu kilku godzin [4].
Ryc. 6. Ofiara epidemii cholery na Haiti w roku 2013 [5].
Wirusoterapia (wiroterapia) to wschodząca gałąź medycyny, która bada zastosowanie przeprogramowanych wirusów do leczenia różnych chorób, w tym nowotworowych.
Istnieją trzy główne kierunki wykorzystania wirusów w wiroterapii: przeciwnowotworowe wirusy onkolityczne, wektory wirusowe do terapii genowej i immunoterapia wirusowa.
Ale na początek wprowadzenie:
Do przeżycia i rozwoju komórek nowotworowych w guzie niezbędne jest wytworzenie własnych naczyń krwionośnych (angiogeneza) oraz wykształcenie się specyficznego mikrośrodowiska (malicious tumor microenvironment, TME). Tworzenie się nowych naczyń krwionośnych w guzie jest ważnym procesem we wzroście i przerzutowaniu nowotworów, i służy do transportu składników odżywczych oraz usuwania odpadów metabolicznych z komórek nowotworowych.
Komórki złośliwego guza rekrutują prawidłowe komórki, tworząc ostatecznie środowisko składające się z komórek nowotworowych, komórek śródbłonka, komórek odpornościowych, fibroblastów, makrofagów i macierzy zewnątrzkomórkowej otaczającej lub naciekającej tkanki nowotworowe, a także substancji rozpuszczalnych, takich jak cytokiny i czynniki wzrostu wydzielane przez te komórki – to właśnie nazywamy mikrośrodowiskiem nowotworu. Uważa się, że przyczyną niskiej skuteczności terapeutycznej obecnych leków przeciwnowotworowych jest wysoka, lokalna produkcja czynników napędzających unaczynienie guza, a także niedotlenienie (hipoksja). Niedotlenienie to niefizjologiczne obniżenie poziomu tlenu, zjawisko powszechne u większości nowotworów złośliwych. Hipoksja guza prowadzi do zaawansowanego, ale dysfunkcyjnego unaczynienia i nabycia takiego fenotypu komórkowego, które skutkuje wzrostem mobilności komórek i przerzutami.
I teraz …
Wirusy z powodu wywoływania straszliwych chorób były kiedyś kojarzone ze złym diabłem albo złośliwym gnomem, jednak wirusy onkolityczne (oncolytic viruses, OV) można porównać do szlachetnych aniołów, ponieważ mogą ratować życie. Wirusoterapia onkolityczna to nowatorskie podejście do leczenia nowotworów, w którym wirusy selektywnie replikują się w komórkach nowotworowych niszcząc je (onkoliza), a jednocześnie pozostawiając prawidłowe komórki nieuszkodzone. Początkowo, w XX wieku, badania prowadzone nad działaniem onkolitycznym opierały się na ogół na wirusach występujących naturalnie, takich jak wirus Zachodniego Nilu, wirus wścieklizny, żółtej febry, zapalenia wątroby. Później zaczęto modyfikować te wirusy za pomocą inżynierii genetycznej. Zmodyfikowane OV wyposażone w pożądane geny mogą wywierać głębokie działanie przeciwnowotworowe poprzez różne mechanizmy. Początkowo głównym celem rekonstrukcji wirusów była poprawa ich specyficzności wobec komórki docelowej, selektywnej replikacji i onkolizy. Dość szybko doceniono przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną specyficzną dla antygenów wirusowych podczas lizy (rozpadu) guza, co stanowi kolejną zaletę OV jako narzędzia immunoterapii. Dlatego też zaczęto zmieniać strategie w kierunku opracowania wektorów wirusowych w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej w nowotworach i przeciwdziałaniu złośliwemu mikrośrodowisku nowotworu. Możemy zatem wyobrazić sobie wirusy onkolityczne jako „żołnierzy” wyposażonych w różnorodną „wyrafinowaną broń”, aby radzić sobie w różnych sytuacjach, w tym dokonać maksymalnego uszkodzenia nowotworu.
Wyniki terapii z wykorzystaniem wirusów onkolitycznych zależą od trójstronnego wyścigu między replikacją wirusa, aktywacją immunologiczną i wzrostem guza. W przeciwieństwie do konwencjonalnej chemioradioterapii, OV precyzyjnie dokonują lizy komórek nowotworowych poprzez interakcję ze specyficznymi receptorami komórkowymi. Korzyści wynikające z różnych form śmierci komórkowej są różne ze względu na charakterystykę wektorów wirusowych i typ komórek nowotworowych, ale większość z nich może ostatecznie wywołać tzw. immunogenną śmierć komórek poprzez uwolnienie antygenów związanych z nowotworem i inicjacji przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej. Inicjacja odporności, wspomaganie infiltracji doguzowej komórek odpornościowych, odwrócenie immunosupresyjnego działania mikrośrodowiska – wirusy onkolityczne mogą używać wielu „broni”, aby systematycznie i kompleksowo zabijać nowotwory na wiele sposobów.
Nie można jednak ignorować faktu, że wirusy onkolityczne mogą same wywołać odpowiedź przeciwwirusową. Dlatego wybór i projektowanie wektorów wirusów jest zróżnicowane i elastyczne, biorąc pod uwagę równowagę między wirusami, mikrośrodowiskiem nowotworu i odpornością gospodarza.
Do tej pory naukowcy przeprowadzili szereg przedklinicznych prób i badań klinicznych zarówno z naturalnie występującymi OV (np. reowirusem i wirusem pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej VSV), jak i genetycznie zmodyfikowanymi OV (np. adenowirusem, wirusem krowianki i wirusem opryszczki) z zachęcającymi efektami. Od preparatu H101 stosowanego w leczeniu raka jamy nosowo-gardłowej przyjętego w Chinach w 2005 r. po Delytact stosowany w leczeniu glejaka złośliwego zatwierdzonego w Japonii w 2021 r. Wirusy onkolityczne stopniowo znajdują swoje miejsce jako silna broń przeciwnowotworowa w leczeniu raka. Naukowcy odkryli, że OV idealnie nadają się do strategii skojarzonych, czyli w połączeniu z radio- i chemioterapią. Rozwój metod skojarzonych z zastosowaniem leków przeciwnowotworowych zapewnia synergiczne lub dodatkowe korzyści w walce z nowotworem, dla których wymagana jest walidacja kliniczna w drodze dobrze zaprojektowanych i statystycznie uzasadnionych badań klinicznych.
W wirusoterapii wykorzystuje się najczęściej cztery gatunki wirusów:
Wirus opryszczki pospolitej (herpes simplex virus, HSV) (Ryc. 1), jest wirusem otoczkowym z podwójną nicią DNA (double stranded DNA, dsDNA) jako materiałem genetycznym. Jego duży genom o długości co najmniej 150 kb zapewnia możliwość insercji (wbudowania) stosunkowo dużych, dodatkowych fragmentów DNA. Na powierzchni otoczki znajdują się cztery główne glikoproteiny wirusowe, gB, gD, gH i gL, umożliwiając wirusowi wiązanie z różnymi receptorami komórkowymi. Jako wirus cytolityczny, HSV może infekować wiele typów komórek nowotworowych i szybko się w nich replikować, łatwo rozprzestrzeniając wirusy potomne na kolejne komórki nowotworowe. W celu przeciwdziałania ewentualnej zjadliwości onkolitycznego HSV można zastosować leki, takie jak acyklowir. Mimo że ponad połowa populacji posiada przeciwciała neutralizujące tego wirusa, to nadal może on uniknąć odporności gospodarza za pomocą różnych mechanizmów, co czyni go idealnym wektorem. Obecnie HSV-1 (wirus opryszczki wargowej) jest jednym z najczęściej używanych szczepów OV, takich jak T-VEC, G207 i G47Δ. Wirus HSV-2 (wirus opryszczki genitalnej) również przyciąga coraz większą uwagę i jest obecnie przedmiotem badań. W przypadku onkolitycznego HSV-2 o nazwie OH2 rozpoczęto niedawno badania kliniczne I/II fazy na guzach litych.
Adenowirusy to bezotoczkowe wirusy o wymiarach 90–100 nm, składające się z genomu dsDNA o wielkości około 26–45 kb otoczonego dwudziestościennym kapsydem z charakterystycznymi wypustkami odpowiedzialnymi za identyfikację receptorów komórkowych (Ryc. 2). Te wypustki adenowirusa można zmodyfikować w celu selektywnego ukierunkowania do konkretnych komórek. Spośród łącznie 57 różnych serotypów, Ad2 i Ad5 są najpowszechniej stosowane jako adenowirusy onkolityczne.
E1A i E1B to kluczowe wczesne geny, które aktywują replikację i transkrypcję kolejnych genów wirusowych Ad2 i Ad5. Jednak mają one właściwości onkogenne, a zatem przed wykorzystaniem adenowirusów jako wektorów muszą być usunięte. Adenowirusy są jednymi z najczęściej badanych wirusów, ponieważ szybko i wydajnie się replikują, można nimi łatwo manipulować i posiadają silną aktywność lityczną. Ponieważ adenowirus charakteryzuje się rozległym tropizmem tkankowym (może zakażać wiele różnych komórek), należy wzmacniać selektywną replikację adenowirusów tylko w komórkach nowotworowych w celu zapewnienia bezpieczeństwa biologicznego. Pierwszym rekombinowanym adenowirusem był szczep Onyx-015. Atenuację i warunkową replikację Onyx-015 uzyskano poprzez usunięcie genu E1B, blokując tym samym ekspresję onkogennego białka E1B-55kD. Ta delecja uniemożliwia replikację Onyx-015 w prawidłowych komórkach. Onyx-015 był badany w kilku badaniach klinicznych pod kątem różnych nowotworów, w tym glejaka złośliwego (stopień III i IV). Chociaż na podstawie analizy histologicznej w guzach zidentyfikowano naciekające limfocyty i komórki plazmatyczne (produkujące przeciwciała), to nie wykazano jednoznacznej odpowiedzi przeciwnowotworowej. Badania nad lekiem Onyx-015 ostatecznie przerwano po nieudanym badaniu III fazy z udziałem pacjentów z nowotworami głowy i szyi.
Wirus krowianki to wirus dsDNA o wielkości około 190 kb, należący do rodzaju ortopokswirusów. Cząsteczka wirusa ma wymiar około 270 × 350 nm i wyglądem przypomina cegłę. Selektywne ukierunkowanie wirusa krowianki jest w dużym stopniu zależne od kinazy tymidynowej, enzymu niezbędny do replikacji wirusa. Wirusowa kinaza zwykle ulega nadekspresji w komórkach złośliwych, ale rzadko w komórkach prawidłowych. W ten sposób naukowcy wygenerowali szczep wirusa krowianki z nokautem* genu kinazy, który replikuje się wyłącznie w komórkach nowotworowych. Do najważniejszych zalet wirusa krowianki należą dobrze poznany genom, szybkie i skuteczne rozprzestrzenianie się wirusa, a także możliwość insercji dodatkowych genów. Najsłynniejszy onkolityczny szczep wirusa krowianki JX-594 można podawać dożylnie, ponieważ opiera się działaniu przeciwciał i dopełniacza.
Reowirus to bezotoczkowy wirus dsRNA, który przedostaje się do komórki gospodarza głównie poprzez endocytozę za pośrednictwem komórkowego receptora JAM-A (Ryc. 4). Okazuje się, że wiele komórek nowotworowych wykazuje nadekspresję tego receptora, np. w raku piersi, niedrobnokomórkowym raku płuc, chłoniaku rozlanym z dużych komórek B i szpiczaku mnogim (to zapewnia selektywność adhezji wirusa do komórek nowotworowych). Innym mechanizmem selektywnego atakowania przez reowirusa komórek nowotworowych jest dominująca mutacja genu/sygnalizacji RAS w nowotworach (odpowiadająca m.in. za unikanie apoptozy). Powoduje ona inaktywację komórkowej kinazy proteinowej R (protein kinase R, PKR), białka przeciwwirusowego, które reguluje translację mRNA oraz reguluje apoptozę i proliferację komórek. W prawidłowych komórkach, PKR może wiązać się z dsRNA reowirusa blokując jego replikację (czyli aktywność wirusa zostaje zahamowana, co jest niekorzystne). A zatem, w komórkach nowotworowych z zablokowaną funkcją PKR nie będzie dochodziło do hamowania replikacji onkolitycznego reowirusa, który będzie powodował ich lizę. Szczep reowirusa Dearing typu 3 (T3D) został wykorzystany do stworzenia komercyjnego wirusa onkolitycznego o nazwie Reolysin. Jest przeznaczony do stosowania dożylnego i prezentuje silne działanie przeciwnowotworowe, nie wykazując żadnej toksyczności ani podrażnienia, które mogłoby ograniczyć dawkę.
Jak wygląda szkolenie wirusów dzikich (występujących naturalnie) na „wykwalifikowanych żołnierzy”?
Po pierwsze – poprawa selektywności wirusów ukierunkowanej na nowotwór
Szkolenie wirusów typu dzikiego na wyspecjalizowane wirusy onkolityczne specyficzne dla nowotworu jest warunkiem wstępnym, który można opisać jako szkolenie cywilów na rekrutów, co może nastąpić albo w procesie infekcji, albo replikacji. Proces szkolenia należy przeprowadzić zgodnie z charakterystyką samych wirusów oraz komórek nowotworowych. Różne gatunki wirusów wykazują odmienne naturalne powinowactwo i preferencje do replikacji w różnych komórkach nowotworowych, podczas gdy genetycznie zmodyfikowane wirusy onkolityczne zaprojektowano z myślą o zwiększonej zdolności celowania w nowotwory. Istnieją dwie główne strategie takich modyfikacji; pierwszym jest zwiększenie powinowactwa i aktywności wiązania wirusów z receptorami na powierzchni nowotworu, u którego ulegają one nadekspresji (jak w przypadku nowotworu piersi). Alternatywnie dokładność celu można zwiększyć poprzez wykorzystanie charakterystyki komórek nowotworowych w celu selektywnej poprawy wydajności replikacji wirusa. Przykłady?
Ze względu na zmienione szlaki sygnalizacyjne w komórkach nowotworowych, ekspresja niektórych receptorów ulega zwiększeniu. Na przykład CD155 ulega nadekspresji na powierzchni wielu komórek nowotworowych, co sprzyja ich inwazji i migracji. Tak się składa, że jest to naturalny receptor dla wirusa polio, dzięki któremu wirus polio może selektywnie infekować komórki nowotworowe. Z kolei białko powierzchniowe gD wirusa opryszczki wiąże się z jego komórkowym mediatorem wejścia (HVEM), którego gęstość na powierzchni komórek jest zwiększona w przypadku czerniaka, raka żołądka i raka wątrobowokomórkowego.
Po drugie – zwiększanie wydajności replikacji wirusów onkolitycznych w cytoplazmie komórek nowotworowych
Poprawa zdolności replikacji wirusów litycznych jest skutecznym podejściem do opracowania ukierunkowanych terapii przeciwwirusowych. Niektóre wirusy mają własne mechanizmy sprzyjające replikacji. Na przykład białko B18R wytwarzane przez niektóre ortopokswirusy blokuje podjednostkę α receptora dla interferonu, hamując odpowiedź przeciwwirusową komórek i promując replikację wirusa. Z kolei mutacja w genie α47 wirusa opryszczki powoduje wczesną ekspresję genu US11, który indukuje replikację wirusa w komórkach nowotworowych – dlatego tak zmodyfikowany onkolityczny wirus opryszczki został zatwierdzony przez Agencję ds. Żywności i Leków (Food and Drug Administration, FDA) jako pierwsza wirusoterapia w leczeniu czerniaka (preparat Talimogene laherparepvec, T-VEC).
Zarówno utrata genów supresorowych nowotworu, jak i rozregulowanie szlaków sygnalizacyjnych w komórkach nowotworowych pomogłyby w selektywnej replikacji wirusa. W przypadku adenowirusów gen kodujący E1B, który może utrzymywać wirusa przy życiu w komórkach, został usunięty w wielu onkolitycznych wirusach, takich jak szczepy adenowirusów H101 i ONYX-015. Jaka jest z tego korzyść? W przypadku infekcji komórek prawidłowych tak zmodyfikowanymi adenowirusami dochodzi do ich apoptozy ze względu na prawidłowe działanie białka p53 (jest to przeciwwirusowa obrona komórki). Z kolei w komórkach nowotworowych białko p53 jest często zmutowane, a zatem komórka nie podlega apoptozie i wirus może litycznie się replikować.
Po trzecie – bezpieczeństwo wirusów onkolitycznych
Wirusy od dawna są postrzegane jako mikroorganizmy chorobotwórcze. Z tego względu kwestionowano bezpieczeństwo wirusów onkolitycznych, zwłaszcza naturalnych (bez modyfikacji), które, jak udowodniono, zabijając komórki nowotworowe niszczą jednocześnie komórki prawidłowe. Dlatego też, należy wprowadzić odpowiednie modyfikacje wirusów onkolitycznych w celu zwiększenia ich bezpieczeństwa dla pacjenta.
A. „Zimna broń” – onkowirusy jako włócznia precyzyjnie wycelowana w komórki nowotworowe
Kiedy wreszcie „wykwalifikowani żołnierze” nabędą umiejętności precyzyjnego namierzenia celu, selektywnej replikacji i będą bezpieczni dla organizmu, są proszeni o zabranie broni do walki z komórkami nowotworowymi. O co chodzi?
Przez ostatnie dziesięciolecia mechanizmy przeciwnowotworowe wirusów onkolitycznych skupiały się głównie na bezpośredniej lizie transformowanych komórek. Jednak tego typu śmierć nie jest korzystna dla organizmu, ponieważ wyzwala reakcje zapalne (czy na pewno? O tym będzie dalej).
Apoptoza, nazywana cichą i spokojną śmiercią komórki, może być wywoływana przez spotkanie tzw. komórkowych „receptorów śmierci” z odpowiednimi ligandami (czyli cząsteczkami, które przyłączając się do tych receptorów indukują apoptozę). Na początkowym etapie infekcji różne wirusy mogą manipulować specyficznymi czynnikami sygnalizacyjnymi w komórkach nowotworowych, aby zahamować apoptozę, zapewniając sobie wystarczający czas i przestrzeń na replikację i reprodukcję. Dlatego, naukowcy „włączają” do specyficznych wobec komórek nowotworowych wirusów białka mające za zadanie połączenie się z „receptorami śmierci” i wywołanie apoptozy tych transformowanych komórek – to jest właśnie ta „zimna broń” (czyli śmierć bez wywołania efektu zapalnego).
Autofagia jest dwulicowym mechanizmem – może utrzymać komórkę przy życiu w warunkach stresowych lub doprowadzić do jej śmierci bez inicjacji procesu zapalnego. Dlatego nie jest łatwym celem w badaniach dotyczących terapii przeciwnowotworowych.
W niektórych eksperymentach próbowano uzbroić wirusy w cząsteczki związane z promocją autofagii, jak na przykład beklinę-1, najczęściej stosowane białko w modyfikacji. Uzbrojenie w beklinę-1 znacząco zwiększało skuteczność terapeutyczną wirusów poprzez indukcję śmierci komórek w hematologicznej białaczce nowotworowopodobnej i szpiczaku. Inne strategie również wskazywały, że może dochodzić do wzmocnienia autofagii komórek nowotworowych jako mechanizmu śmierci. Na przykład szczep onkolitycznego HSV-1 RH2 z niedoborem genu γ34.5 indukował powstawanie autofagosomu i śmierć komórek raka płaskonabłonkowego.
B. „Gorąca broń” – magiczna armata odpornościowa
Naukowcy w coraz większym stopniu skupiają się na immunogenności onkolitycznej wirusów. Dlaczego? Zaraz po lizie komórek nowotworowych uwalniane są potomne wirusy wraz wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami (Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs) i sygnałami DAMPs (Damage-associated molecular patterns – białka, które w zdrowej komórce są zamknięte wewnątrz niej i nie wzbudzają reakcji odpornościowych). PAMPs i DAMPs nakręcają odporność wrodzoną poprzez wiązanie się z receptorami, takimi jak Toll-podobne (Toll-like receptors, TLR) oraz stymulują komórki dendrytyczne i limfocyty NK (natural killer). Te ostatnie wspomagają wirusy w niszczeniu komórek nowotworowych. Natomiast komórki dendrytyczne wychwytują białka wirusowe, aby wywołać odporność adaptacyjną. W efekcie prezentacji antygenów wirusowych przez komórki dendrytyczne limfocytom T, z najbliższych węzłów chłonnych napływają limfocyty T pomocnicze i cytotoksyczne, aby wspomóc walkę z komórkami nowotworowymi. Do tego sama obecność wirusów może stymulować wytwarzanie czynników zapalnych (np. IL-2, IL-12, IL-15, TNF-α) i chemokin (np. CXCL9, CXCL10, CXCL11) przyciągających limfocyty. Jednak problemem jest to, że aktywność naciekających komórek odpornościowych jest hamowana przez komórki immunosupresyjne mikrośrodowiska guza (np. makrofagi związane z nowotworem) i lokalnie produkowane cytokiny przeciwzapalne (np. IL-10, TGF-β). Na szczęście zaproponowano pewne działania pozwalające zmienić „zimny” guz w guz objęty stanem zapalnym, czyli immunologicznie „gorący”. W jaki sposób? Przedstawiono to na poniższej rycinie 5, ale najpierw wyjaśnię, co to jest macierz zewnątrzkomórkowa (extracellular matrix, ECM) „otulająca” guz.
Jako główny składnik mikrośrodowiska guza, macierz zewnątrzkomórkowa zapewnia niszę wzrostową dla większości guzów litych. Tworzy barierę fizyczną i odgrywa kluczową rolę w inicjacji, progresji, przerzutach i lekooporności nowotworu. Wśród nich działanie immunosupresyjne (hamujące odpowiedź immunologiczną) jest głównym mechanizmem progresji nowotworu i niepowodzenia leczenia. Odkładanie się różnych składników wydzielanych przez ECM (np. kolagenu i włókien elastycznych) oraz przebudowa macierzy negatywnie wpływają na naciekanie komórek odpornościowych. Klasycznym przykładem jest macierz zewnątrzkomórkowa gruczolakoraka przewodowego trzustki nazywana „pustynią immunologiczną”. Tradycyjna chemioterapia i ukierunkowana terapia molekularna może utrzymać średni czas przeżycia pacjenta z nieoperacyjnym gruczolakorakiem jedynie przez kilka miesięcy. Naukowcy zdali sobie sprawę, że ECM może służyć jako obiecujący cel terapii przeciwnowotworowych w takich nowotworach, jak rak piersi HER2-dodatni czy glejaki o wysokim stopniu złośliwości, chociaż obecnie nie jest dostępny żaden zatwierdzony lek ukierunkowany na ECM.
Silna immunogenność onkolityczna zmodyfikowanych OV. ① Kiedy OV degradują komórki nowotworowe, jednocześnie uwalniane są wirusy potomne, PAMPs i DAMPs, co wyzwala immunologiczną śmierć komórkową. ② W międzyczasie inicjowana jest odporność wrodzona, gdy komórki dendrytyczne i limfocyty NK współpracują przy usuwaniu komórek guza. ③Komórki dendrytyczne wraz z pochłoniętymi antygenami nowotworowymi szybko migrują do węzłów chłonnych, gdzie aktywowane są limfocyty T, które naciekają ogniska pierwotne i przerzutowe, aby zapewnić odporność nabytą. ④ Ponadto zmodyfikowane OV mają zdolność przełamywania bariery macierzy zewnątrzkomórkowej „otulającej” guz, pobudzając komórki mikrośrodowiska guza do uwalniania czynników zapalnych i chemokin, co odwraca jego immunosupresyjny charakter. ⑤ Dzięki temu wspólnemu wysiłkowi zmodyfikowane OV mogą przekształcić immunologicznie „zimny” guz w „gorący” guz, co przekłada się na ulepszoną i silniejszą odporność przeciwnowotworową.
Pojawienie się leków celowanych wskazuje, że terapia nowotworów wkroczyła w erę medycyny precyzyjnej. Prowadzoną są badania, w których łączy się wirusy onkolityczne z lekami celowanymi. Ze względu na różną biofunkcję leków, dzieli się je głównie na inhibitory angiogenezy, blokujące tworzenie nowych naczyń krwionośnych (np. sorafenib, bewacyzumab), przeciwciała monoklonalne celujące w komórki nowotworowe (np. trastuzumab, cetuximab), inhibitory proteasomów. (np. bortezomib), inhibitory przekazywania sygnału (np. imatynib), inhibitory deacetylazy histonowej (np. worinostat, belinostat), inhibitory naprawy DNA (np. olaparyb). Alternatywnie, leki te można je podzielić na drobnocząsteczkowe lub wielkocząsteczkowe na podstawie ich masy cząsteczkowej. Leki drobnocząsteczkowe mogą przedostawać się do komórek i specyficznie blokować lub konkurować o kluczowe cząsteczki zaangażowane w docelowy szlak sygnalizacyjny, aby mogły odgrywać rolę terapeutyczną. Leki wielkocząsteczkowe zwykle celują w białka błon komórkowych.
Obecnie do obrotu dopuszczone są tylko cztery produkty zawierające wirusy onkolityczne: Rigvir (SND005), Oncorine (H101), Imlygic (Talimogene laherparepvec, T-VEC) i Delytact (teserpaturev/G47Δ).
Rigvir (SND005) to niezmodyfikowany cytopatyczny ludzki sierocy wirus jelitowy typu 7 (ECHO-7), zatwierdzony do leczenia czerniaka na Łotwie w 2004, co czyni go pierwszym zatwierdzonym lekiem onkolitycznym. W 2006 roku w Chinach zarejestrowano adenowirusa Oncorine (H10113) do leczenia raka płaskonabłonkowego głowy, szyi i przełyku. Jednakże skuteczność leczenia tymi wirusami wynika przede wszystkim z ich wrodzonych właściwości onkolitycznych, a nie ze stymulacji odporności przeciwnowotworowej. Dlatego efekt terapeutyczny stosowania jednego leku jest nadal ograniczony, a strategia leczenia koncentruje się bardziej na terapiach skojarzonych.
W 2015 roku amerykańska FDA zatwierdziła T-VEC, atenuowany wirus opryszczki HSV-2 kodujący czynnik wzrostowy dla granulocytów i makrofagów GM-CSF do miejscowego leczenia nieresekcyjnych zmian skórnych, podskórnych i węzłowych u pacjentów z nawrotowym czerniakiem. Niedawno zatwierdzony OV Delytact (G47Δ) (2021 r, Japonia) wykazał korzyści w zakresie wydłużenia czasu przeżycia pacjentów z resztkowym lub nawrotowym glejakiem wielopostaciowym, przy dobrym profilu bezpieczeństwa.
Do 2022 r. na stronie ClinicalTrials.gov zarejestrowano łącznie 329 badań klinicznych związanych z wirusami onkolitycznymi.
Badania nad wirusoterapią wiążą się z wyzwaniami, ponieważ zmniejszenie odporności pacjenta onkologicznego osłabia też reakcję na terapię wirusami onkolitycznymi. Co więcej, istnieje pilna potrzeba opracowania modeli nowotworów, które dokładnie odzwierciedlałyby to, co dzieje się zarówno w guzie zakażonym wirusem onkolitycznym, jak i u gospodarza jako całego organizmu.
* Nokaut genowy – obecnie jest to fundamentalna technika inżynierii genetycznej, która pozwala na unieczynnienie wybranego genu badanego organizmu, a następnie na podstawie obserwowanego efektu fenotypowego umożliwia określenie jego funkcji. Technika ta wykorzystywana jest do tworzenia modeli zwierzęcych służących do badania ludzkich chorób i testowania różnych możliwości ich leczenia. Jak dotąd stworzono ponad 500 mysich modeli różnych chorób, w tym schorzeń sercowo-naczyniowych, chorób neurodegeneracyjnych, cukrzycy i wielu typów raka. Za wprowadzenie tej techniki Mario R. Capecchi (USA), sir Martin Evans (Wielka Brytania) i Oliver Smithies (USA) otrzymali w roku 2007 medycznego Nobla.
