Search Results for: PCR

Jak jeszcze można sprawdzić bezpieczeństwo i skuteczność szczepień przeciw rakom HPV-zależnym? część 2

Piotr RieskeLeave a comment

Publikacja nie jest poradą medyczną. Ma ona charakter popularno-naukowy.

Jak szczepionki przeciw rakom HPV-zależnym są otrzymywane/produkowane i jak działają?

Do syntezy białek szczepionki wykorzystuje się głównie komórki drożdży lub owadów. Są to metody dość często stosowane przez biotechnologów. Posługują się nimi np. do otrzymywania bardzo popularnych ostatnio leków odchudzających (zmniejszających łaknienie) czy nawet produkcji insuliny dla chorych na cukrzycę, głównie typu pierwszego. Takie preparaty są stosowane masowo, codziennie, i nikt nie tworzy z tego powodu teorii spiskowych, jak to ma miejsce w przypadku szczepionek.

Aby rozpocząć produkcję szczepionki przeciw rakom HPV-zależnym ( w tekście użyto czasem skrótu przeciw HPV), do genomu tych organizmów wprowadza się transgeny* kodujące białka L1 i L2 kapsydu wirusa. Następnie przeprowadza się kolejny etap produkcji zmierzający do formulacji (nadawania produktowi formy, w której jest podawany). Białka L1 i L2 mają zdolność do samoskładania się w struktury sferyczne/kuliste. Nazywa się je partykułami wirionopodobnymi lub wirusopodobnymi (ang. viral like particles VLP). W ten sposób powstaje coś, co przypomina zewnętrzną część wirionu. Białka te zostaną oczyszczone bardzo dokładnie dzięki technikom chromatograficznym i filtracjom. W dużym skrócie przykładowa preparatyka: przygotowanie podłoża i inokulum, namnażanie komórek (insektów) w bioreaktorze, klarowanie, redukcja obciążenia biologicznego, ultrafiltracja/diafiltracja, chromatografia oczyszczająca, inaktywacja bakulowirusa lub denaturacja, fałdowanie L1 i L2, chromatografia oczyszczająca, ponowna ultrafiltracja/diafiltracja, filtracja sterylna lub filtracja końcowa. Metody takie pozwalają na tworzenie produktów o dużej czystości.

Tak otrzymane struktury przypominające kapsyd wirionu są wprowadzane w czasie szczepienia do organizmu, a następnie pobierane przez makrofagi i komórki dendrytyczne. Makrofagi i komórki dendrytyczne umożliwiają przygotowanie odpowiedzi (obrony) swoistej przeciw HPV. Oprócz białek stosuje się adiuwanty związków glinu w niewielkich stężeniach. Glin i jego związki występują powszechnie w przyrodzie i jesteśmy przystosowani do życia w takim środowisku. Związki glinu wzmacniają działanie tej szczepionki.

Komórki takie jak makrofagi prezentują potem elementy wirusa limfocytom T i pośrednio B. Dzięki temu odpowiednie klony tych komórek ulegają namnożeniu i przechodzą „szkolenie”. Efekty tego „szkolenia” mogą potem wykorzystać do eliminacji wirusa. Aktywacji ulegają również odpowiednie klony limfocytów B wytwarzających przeciwciała przeciw epitopom (fragmentom antygenów) białek L1 i L2 HPV. Jest to ważne, ponieważ mogą one neutralizować wiriony (partykuły zakaźne wirusa), kiedy te próbują zakażać komórki. Szczepionka prowadzi również do powstania limfocytów T, które niszczą zakażone komórki.

Ogólnie szczepienia są bezpieczne, a te szczepionki nie stwarzają takiego ryzyka jak szczepionki żywe. Te ostatnie stanowią rzadko zagrożenie dla osób z dużymi niedoborami odporności. U takich osób powinno podchodzić się do szczepień szczepionkami żywymi z bardzo dużą ostrożnością. Szczepionki przeciw rakom HPV-zależnym to szczepionki antygenowe (białkowe). Groźne odczyny poszczepienne występują bardzo rzadko. Tych niestety nigdy nie uda się całkowicie uniknąć. Mogą one wynikać np. z nadreaktywności układu odpornościowego u bardzo nielicznych osób.

Przez walentność szczepionki przeciw HPV rozumie się to, przeciw ilu odmianom (typom) HPV została ona zoptymalizowana. Typy wirusów HPV różnią się nieco białkami L1 i L2. Występują też elementy wspólne między nimi. Jest to o tyle ważne, że kiedy pojawiają się nowe szczepy, nie zanika całkowicie ochrona przed nimi po szczepieniu. Jednak nasze układy odpornościowe bardzo się różnią i nie każda osoba wytwarza odporność krzyżową przeciw różnym typom HPV.

Szczepionki te mogą być łatwo poprawiane dzięki zastosowanej technologii konstrukcyjnej i produkcyjnej. Do komórek owadów wprowadzać można transgeny* różnych typów HPV. W ten sposób powstają „sfery” przypominające kapsydy różnych typów tego wirusa. Na szczęście między L1 i L2 różnych typów wirusów występują podobieństwa. W konsekwencji szczególnie odpowiedź limfocytów T eliminujących komórki zakażone może być krzyżowa – przeciw różnym typom HPV. Nie jest to jednak dla wakcynologów powód, żeby spoczywać na laurach i nie poprawiać szczepionek. Powstają już szczepionki przeciw kilkunastu typom HPV. Wirus jest „pomysłowy”. Ale coraz trudniej mu unikać odpowiedzi krzyżowej wobec różnych typów. Jego kapsyd nie może mieć dowolnych zmian, aby zachować zakaźność. Nie jest wykluczone, że powstaną szczepionki nowej generacji oparte o inne, niż opisane tu technologie.

*Formalnie nie transgeny, tylko tzw. otwarte ramki odczytu kodujące te białka; w przypadku wirusów trudno mówić o genach sensu stricto.

Niepożądane odczyny poszczepienne (NOP-y) w kontekście przewidywanych korzyści wynikających ze szczepień przeciw rakom HPV-zależnym

Niestety nie ma całkowicie bezpiecznych procedur medycznych. Niektóre metody usuwania zmian przedrakowych spowodowanych przez HPV prowadzą u około 1% osób poddanych zabiegom – do pewnych komplikacji, takich jak np. stenoza szyjki macicy. Nie jest to olbrzymi problem zdrowotny i nie powinno to absolutnie zniechęcać do profilaktyki, ale z punktu widzenia szczepień profilaktycznych takie powikłanie byłoby istotnym „NOP-em”. Nie można liczyć na procedury pozbawione ryzyka, komplikacji zupełnie nieporównywalnych jednak z konsekwencjami samego raka. W czasie badań cytologicznych pojawiają się niestety błędy. Połączenie różnych badań pozwala zmniejszyć ich prawdopodobieństwo. Jeśli więc jest to możliwe, zaleca się korzystanie zarówno ze szczepień, jak i badań profilaktycznych.

Warto podkreślić, że istnieje różnica między czymś, co jest podejrzeniem niepożądanego odczynu poszczepiennego, a czymś, co nim jest faktycznie. Są również NOP-y, w przypadku których trudno winić firmy odpowiedzialne za sprzedaż szczepionek czy regulatorów dopuszczających je do obrotu.

Przykładowo, wśród NOP-ów po szczepieniu przeciw HPV występują reakcje lękowe. Reakcje lękowe są trudne do uniknięcia, ale mimo to słusznie są nazywane NOP-ami. Jest to w dużej mierze reakcja na szczepienie, a przynajmniej procedurę z nim związaną. Sam widok igły wbijanej w ciało jest dla wielu ludzi czymś przykrym. Ruchy antyszczepionkowe na pewno do takich sytuacji się przyczyniają. W trakcie badań klinicznych szczepionek reakcje lękowe, bóle głowy czy nawet gorączka zgłaszane są również wśród osób, które otrzymują placebo (jest to czasem sól fizjologiczna, niekiedy adiuwant).

O ile ból w miejscu ukłucia jest czymś naturalnym, to zgłaszanie gorączki z powodu otrzymania placebo świadczy o dużym stresie u takich osób lub koincydencji innego zjawiska powodującego taki stan. Nie da się tego jednak zawsze wytłumaczyć koincydencją, ponieważ chociażby w badaniu jednej ze szczepionek przeciw COVID-19 gorączkę w grupie placebo (ci badani otrzymali zastrzyk z soli fizjologicznej) zgłoszono niewiele rzadziej niż w grupie, która otrzymała szczepionkę.

Ocenia się, że w przypadku szczepionek przeciw HPV NOP-y, które wymagały pomocy medycznej, występują z częstością kilkunastu na 100 tysięcy podań. Z tym, że częstość NOP-ów spowodowanych przez szczepionki przeciw rakom HPV-zależnym maleje. Od 2008 do 2018 liczba w ogóle zgłaszanych niepożądanych reakcji poszczepiennych na 100 000 zmalała z ok. 100 do kilku–kilkunastu w zależności od grupy wiekowej.

Występowały anafilaksje, wspomniane reakcje lękowe, pojawiał się rumień w okolicy wkłucia.

Nie potwierdzono związków szczepień z niektórymi chorobami/zespołami autoimmunologicznymi: zespołem Guillain-Barre, stwardnieniem rozsianym, bezpłodnością, stwardnieniem zanikowym bocznym, zapaleniem nerwu i rdzenia wzrokowego, zapaleniem trzustki i wielu innymi. Jest to jednak nadal bardzo uważnie monitorowane.

Zgłoszone podejrzenie NOP, czy nawet rejestracja NOP (w Polsce) nie musi oznaczać, że problem spowodowało szczepienie. W przypadku rumienia czy reakcji anafilaktycznej sprawa jest dość oczywista. Natomiast problemy odległe, takie jak jest zespół Guillain-Barre czy stwardnienie rozsiane, występują w populacji osób nieszczepionych. Dlatego nie można traktować każdego przypadku wystąpienia takiej sytuacji jako spowodowanego szczepieniem.

Wymagane jest nie tylko wykrycie takich przypadków w populacji osób zaszczepionych, ale wykrycie ich z większą częstością niż w populacji ogólnej. Jednocześnie jednak wszystkie takie przypadki są brane pod uwagę i analizowane. Zapewne dokładne wyjaśnienie etiologii takich chorób będzie stanowiło ważny krok w wyjaśnieniu, jaka jest ich przyczyna, a wtedy – czy jest to konsekwencja szczepienia, czy przypadek niezależny od szczepienia. Szczepienia nie są i nie mogą być neutralne dla organizmu.

Wypada tu także przypomnieć, że w czasie badań klinicznych jednej ze szczepionek przeciw rakom HPV-zależnym, w grupie placebo (osoby, które nie otrzymały szczepionki) dochodziło do zdarzeń, których nie można wiązać ze szczepieniem częściej niż w grupie badanej. Były to np. przypadki przedawkowania narkotyków czy śmierć w wyniku postrzału. Pokazuje to, że nie można w sposób bezkrytyczny oceniać bezpieczeństwa szczepień tylko dlatego, że jakieś zdarzenie częściej miało miejsce w jakiejś grupie osób objętych badaniem klinicznym.

W ten sposób można by, posługując się retoryką antyszczepionkowców, twierdzić, że to szczepienie chroni przed postrzałem czy przedawkowaniem z powodu narkotyków, bo takich sytuacji było mniej w grupie kontrolnej (placebo) w czasie badań jednej ze szczepionek przeciw rakom HPV-zależnym. Nikt poważny nie wyciąga jednak z tego wniosku, że szczepienia chronią przed śmiercią w wyniku postrzału. Natomiast ruchy antyszczepionkowe wykorzystują perfidnie każdą sytuację, kiedy w badaniach klinicznych wykryto jakieś zjawisko częściej po szczepieniu niż w grupie placebo (ale nie częściej niż w populacji ogólnej), i chcą obwiniać szczepienia.

Tymczasem nie zawsze w czasie badań klinicznych dochodzi do pewnych zdarzeń tak często, jak w populacji ogólnej. Wynika to np. z faktu, że pewne choroby występują zbyt rzadko, by można było je zaobserwować z taką samą częstością w badaniach klinicznych jak w populacji ogólnej. Nie można więc każdej różnicy między grupą badaną a placebo traktować jako związek przyczynowo-skutkowy. Po zakończeniu badań klinicznych przez wiele lat monitoruje się więc nadal wpływ szczepień populacyjnie. Oczywiście po udowodnieniu, że szczepienie spowodowało uszczerbek na zdrowiu, powinno być wypłacane odszkodowanie.

Problem NOP-ów należy postrzegać w kontekście tego, do jakiej ochrony szczepienia się przyczyniają. W Polsce na raka szyjki macicy zapada rocznie około 3500 kobiet. Oznaczać to może, że w ciągu 20 lat w Polsce zachoruje ponad 70 tysięcy kobiet, a około 35 tysięcy umrze, jeśli nie nastąpi jakaś olbrzymia pozytywna zmiana w terapii i/lub diagnostyce.  Kolejne 40 000 raków HPV-zależnych może wystąpić u mężczyzn i kobiet, i te również doprowadzą do tysięcy śmierci. Jak wspomniano powyżej, podejście diagnostyczne może się zmienić na trwałe, ale nie jest jasne, jakie będą tego konsekwencje.

Odpowiednie działania mogą zapobiec części tych zachorowań i śmierci. Z jednej strony progres w terapii w ciągu poprzednich 20 lat był ogromny. Z drugiej strony program prezydenta Nixona pokonania raka w ciągu kilku lat – ogłoszony 50 lat temu – okazał się być mrzonką. Od teraz licząc, za 30-40 lat w Polsce połączenie diagnostyki, terapii, obecnych i udoskonalonych szczepień może zapobiec nawet 90% zachorowań i śmierci z powodu raków HPV-zależnych. Na świecie działania takie mogą zapobiec ok. 45 milionom śmierci z powodu samego raka szyjki macicy do końca XXI wieku. Jeśli zaszczepionych zostanie w ciągu kolejnych lat 20 milionów polskich dzieci, kiedy będą w wieku pomiędzy 11, a 14 rokiem życia to NOP-y, które będą wymagały ewidentnej pomocy medycznej i naprawdę wynikające ze szczepienia, wystąpiłyby wtedy u kilkuset osób przez 20 lat.

Zakładając nawet w tym przypadku, że taka częstość NOP-ów zostanie potwierdzona jako wynikająca ze szczepień, to widać możliwość zapobieżenia około 60 tysiącom raków szyjki macicy i kolejnych kilkudziesięciu tysiącom innych HPV-zależnych raków w Polsce (szacunkowo około 100 tysięcy dzięki 20-30 letnim szczepieniom), przy kilkuset bardzo groźnych NOP-ach. NOP-y będą zdecydowanie mniej groźne niż raki HPV-zależne. Instytucje regulatorowe zgadzają się na taką relację korzyści do szkód. Nie ma w tym przypadku na tę chwilę innej możliwości szacowania zysków zdrowotnych do takich strat niż przez tego typu modelowania. W szacowaniu tym nie daje się obecnie przewidzieć, czy nie pojawi się jakaś lepsza terapia albo metoda wczesnej diagnostyki.

W Japonii od 2013 roku do 2022 roku nie wspierano w sposób zdecydowany programu szczepień. Wynikało to z dezinformacji na temat NOP-ów. Japońscy specjaliści od zdrowia publicznego uważają ten czas za stracony. Analizy opublikowane w czasopiśmie Lancet wskazują, że zaniechania te przyczyniły się do około 20000 przypadków raka szyjki macicy. Nie ma danych na temat tego, jakiej liczbie przypadków innych raków HPV-zależnych nie zapobieżono z powodu dezinformacji. Na całym świecie już w tej chwili szczepienia zapobiegają tysiącom raków HPV-zależnych. Na razie są to i tak liczby stosunkowo niewielkie ponieważ minęło około 20 lat od rozpoczęcia szczepień, a osoby młodsze rzadziej chorują na takie nowotwory złośliwe.

Szczepienia nie są jedyną metodą profilaktyki zapobiegającej rakom HPV-zależnym. Osoby zaszczepione nadal powinny korzystać z innych możliwości profilaktycznych.

Dlaczego szczepienia przeciw rakom HPV-zależnym są skuteczniejsze, jeśli zostaną wykonane do 14 roku życia?

Badania z ostatnich 20 lat dowodzą, że największą skuteczność obserwuje się, jeśli szczepienia przeciw HPV, wykonuje się przed 14 rokiem życia. Zapewne znaczenie ma to, że szczepienie daje lepsze efekty zanim doszło do zakażenia. Wiadomo jednak również, że niekiedy szczepienie w młodszym wieku zwiększa skuteczność. Układ odpornościowy tworzy wtedy silniejszą i sprawniejszą odpowiedź. Grasica, która jest „szkołą” układu odpornościowego, zaczyna zanikać już od drugiego roku życia. Okres pokwitania przyspiesza ten proces. Przykładem klasycznym, który obrazuje wpływ wieku na skuteczność szczepienia, jest gruźlica. Zaszczepione przeciw gruźlicy dzieci mają o wiele lepszą (szerszą) ochronę niż zaszczepieni dorośli. Nikt nie ukrywa, że jeszcze wszystkiego nie wiemy o biologii nowotworów HPV-zależnych i działaniu układu odpornościowego. Ale wiadomo, że nie powinno się czekać następne 15 lat, żeby stwierdzić sensowność tych szczepień.

Na pewno będzie analizowane, czy nie powinno się – ujmując to kolokwialnie – doszczepiać, jeśli odporność pozwalająca szybko zwalczać infekcje HPV wygasa np. po 15 latach. Oznaczałoby to ryzyko przesunięcia spłaszczonego (mniej chorych wśród zaszczepionych) szczytu zachorowań z wieku ok. 55 na np. 70 rok życia, jeśli chodzi o raka szyjki macicy. Biorąc pod uwagę, że 50% Polek z rakiem szyjki macicy umiera, wydłużeniem im życia nawet o 15 lat dzięki szczepieniom, byłoby bezcenne. Zjawiska takie będą analizowane. Obecnie dostępne dane podważają taki scenariusz. Przykładowo badania z Lancet Oncology (badanie PATRICIA) wykazało utrzymywanie się wysokiego stężenia przeciwciał przeciwko HPV-16/18, przez co najmniej 10–12 lat, a modelowanie sugeruje ochronę nawet przez 50 lat.

Nowy szczyt zachorowań byłby bardzo spłaszczony (niższy), ale to nie znaczy, że taka pesymistyczna możliwość – chociaż mało prawdopodobna – jest lekceważona. Szczyt zachorowań byłby spłaszczony chociażby dlatego, że część osób zakażonych w czasie założonych tu pesymistycznie 15 lat ochronnych od szczepienia powinno zwalczyć łatwiej infekcję (powinno się jej mimo to unikać) i wytworzyć silniejszą odpowiedź na dłuższy czas. Wirus (wiriony) to nie tylko białka L1 i L2 użyte w szczepionce.

Odpowiedź immunologiczna po zakażeniu dotyczy wielu białek wirusa i jest to odpowiedź zarówno oparta na przeciwciałach, jak i limfocytach T. Skuteczna odpowiedź limfocytów T po zakażeniu dotyczy także białek znajdujących się wewnątrz kapsydu, których szczepionka nie zawiera. Jest ich wiele, a inne typy tego wirusa nie mogą się różnić pod każdym względem. Nie powinno być to oczywiście traktowane jako zachęta do zakażania się w czasie posiadania ochrony poszczepiennej. Wręcz przeciwnie. Posiadanie jednego wiernego partnera/partnerki i wierność jemu/jej jest bardzo skuteczną metodą zapobiegania tym rakom.

Chociaż, jak podkreślono, zakażenia np. w toalecie czy po używaniu cudzego ręcznika mogą się zdarzyć. Nawet jeśli ochrona poszczepienna jest przejściowa i kilkunastoletnia (aktualne dane sugerują dłuższą), to liczba raków wśród zaszczepionych spadnie również dlatego, że część z zaszczepionych ustabilizuje w czasie posiadania odporności swoje relacje intymne. Może się oczywiście zdarzyć, że ze względu na zmiany społeczne całkowita liczba zachorowań będzie rosła, bo zwiększy się odsetek zakażonych wśród niezaszczepionych, jeśli ich grupa pozostanie bardzo liczna. Gdyby nawet nie doszło do doszczepienia, czy zakażania w czasie ochronnym, a skrajnie pesymistyczne i nieprawdopodobne scenariusze sprawdziłyby się, to przesunięcie spłaszczonego szczytu zachorowań na późniejszy wiek byłoby nadal sukcesem. Oznaczałoby to wydłużenie życie tysiącom osób w Polsce o wiele lat.

Względnie poprawnym markerem stanu odporności jest miano przeciwciał przeciw białkom HPV we krwi. Przeprowadzanie tego typu badań, do oceniania odporności nie jest jednak popularne i wątpliwe, aby takim się stało. Jest też mało prawdopodobne, aby udało się wykonywać takie testy rutynowo po to, by stwierdzić przeciw ilu odmianom HPV istnieje odpowiedź. Istnieją epitopy wspólne dla różnych typów wirusa i naukowo byłoby ciekawe stwierdzić, jaki odsetek zaszczepionych jest chroniony w ten sposób. Przypomnieć tu jeszcze wypada, że ważna jest też odpowiedź komórkowa cytotoksyczna, a nie tylko humoralna (przeciwciała). Dla badania odporności cytotoksycznej testy są bardzo drogie.

Profilaktyka inna niż szczepienia

U tych kobiet, u których nie doszło do eliminacji zakażenia HPV, obserwować można kolejne stany przedrakowe raka szyjki macicy. CIN-1 cofa się spontanicznie w większości przypadków, ale CIN-3 już tylko w około 50%. Ginekolog ma prawo mimo to podjąć razem z pacjentką decyzję o usunięciu CIN-1. Jak wspomniano, nie ma interwencji całkowicie pozbawionych ryzyka, ale korzyści także tutaj przewyższają ryzyka zdrowotne. Łatwiej to robić w przypadku tych zmian przedrakowych, bo można pobierać komórki do badań cytologicznych z szyjki macicy. Jeśli lekarzowi uda się zaobserwować taką zmianę u kobiety, wtedy może ją usunąć. Pomaga tu również fakt, że stanów przedrakowych raka szyjki macicy wyróżnić można co najmniej trzy. Nawet wychwycenie zmiany na trzecim etapie pozwala uniknąć dramatów.

Coraz częściej poza badaniami cytologicznymi pomocne są również badania technikami biologii molekularnej, takimi jak PCR. Nowe wytyczne diagnostyczne mogą kłaść większy nacisk na ich zastosowanie w diagnostyce np. zmian przedrakowych. Istnienie tego typu procedur ułatwić ma też samobadanie. Określenie samobadanie jest często pewnym uproszczeniem, ponieważ nikt nie wymaga od kobiety wykonania samodzielnie testu PCR. Dlatego czasem używa się określenia samopobranie. Wtedy chodzi oczywiście o pobranie materiału. Pojawiają się już też pierwsze testy antygenowe. Nie chodzi tu o testy ELISA, ale testy kasetkowe i tu już można mówić o samobadaniu.

Testy takie stosuje się coraz częściej, by wykrywać wirusy takie jak grypy czy SARS-CoV-2. Ich czułości diagnostyczna i analityczna siłą rzeczy są niższe niż PCR. Kobiety niechętnie chodzą do ginekologów. Podejście zachęcające do zmiany pierwotnych wizyt u ginekologa na wstępne samobadanie, po którym dopiero może dojść do spotkania z ginekologiem zdaniem niektórych może zbyt często doprowadzić do błędów. Zwracają oni uwagę, że kilka procent raków szyjki macicy jest HPV-niezależnych, a ginekolog może je wykryć w czasie wizyty, na wczesnym etapie. Zaawansowane nowotwory, które rozwinęły się w wyniku infekcji nie muszą być HPV pozytywne (wyjaśniono w części 1). Obrońcy „samobadania” twierdzą natomiast, że jeśli dzięki temu, badania molekularne będą wykonywane przez kobiety częściej (masowo), to ostatecznie wykrywalność zmian przedrakowych powinna wzrosnąć. Jednocześnie powinno się dbać u uświadamianie, że pozytywny test nie oznacza zazwyczaj, że ktoś ma raka.

Testy PCR wykazują o wiele większą czułość diagnostyczną i analityczną niż badania cytologiczne. W przypadku PCR łatwiej też określić typ HPV. Natomiast testy molekularne, nie pozwalają szybko ustalić, czy u pacjentki występuje CIN1, CIN2 czy CIN3 (ang. cervical intraepithelial neoplasia). Klasyfikacja CIN jest klasyfikacją histologiczną, w badaniach cytologicznych wykorzystywana jest np. klasyfikacja Bethesda (przykładowe skrótów od nazw zmian ASC-H LGSIL, HSIL). Klasyfikacja CIN jest natomiast częściej stosowana, by ustalić skuteczność szczepień. Po pozytywnym teście PCR (antygenowym) powinno się wykonać więc badania cytologiczne, a potem ewentualnie histologiczne, chyba że ginekolog natychmiast uzna histologiczne za konieczne. Otrzymanie pozytywnego wyniku PCR, czy antygenowego ma zadziałać jako bodziec zachęcający do udania się do ginekologa.

Zestawy do samodzielnego pobierania materiału zaczynają się pojawiać również dla mężczyzn. Jednak ze względu na olbrzymią różnicę między zrozumieniem/poznaniem rozwoju raka szyjki macicy, a innych raków HPV-zależnych ich rola będzie stopniowo poznawana. Biologia molekularna może wkrótce przyjść tu z większą pomocą, ale wymaga to jeszcze lat pracy, aby poziom tych badań był podobny do poziomu badań wykonywanych dla raków szyjki macicy i zmian przedrakowych w tej lokalizacji.

O ile więc dla HPV-zależnego raka szyjki macicy istnieje dobra rutynowa profilaktyka, to dla raków typowych dla mężczyzn i wspólnych dla kobiet i mężczyzn dopiero jest ona standaryzowana i projektowana.

Wizyta u ginekologa zapewnia skuteczniejszą i bardziej profesjonalną metodę badania materiału niż tzw. samobadanie. Samobadanie (samopobranie) może być natomiast powszechniejsze, pozytywny wynik powinien skłonić do wizyty u ginekologia. Bez wątpienia takie podejście wymaga jednak edukacji społecznej, by nie doszło do nieporozumień i wzbudzania nieuzasadnionego lęku. Możliwe, że również dla mężczyzn powstaną skuteczne testy.

Podsumowanie

Wykazano wielokrotnie skuteczność szczepień przeciw rakom HPV-zależnym. Określono ją przede wszystkim poprzez zmniejszenie odsetka przypadków stanów przedrakowych od CIN1 do CIN3, wśród kobiet zaszczepionych, w porównaniu do kobiet niezaszczepionych. Pojawiają się pierwsze badania dowodzące również, że odsetek raków szyjki macicy wśród zaszczepionych jest zdecydowanie niższy niż u niezaszczepionych (te same grupy wiekowe). Można domniemywać, że podobnie będzie z innymi rakami HPV-zależnymi, także tymi występującymi u mężczyzn.

Szczepienia te ograniczają transmisję HPV pod warunkiem zachowania pewnych zasad społecznych.

Niepożądane odczyny poszczepienne występują w przypadku szczepionek przeciw rakom HPV-zależnym bardzo rzadko. Zebrane dane wskazują, że nie ma związku tych szczepień ze stosunkowo rzadkimi chorobami takimi, jak stwardnienie rozsiane czy zespół Guillaina-Barrégo i innymi analizowanymi chorobami o podłożu autoimmunologicznym. 

Nie oczekuje się, że samymi szczepieniami da się tak bardzo zmniejszyć liczbę zachorowań na raki HPV-zależne, by te przestały być problemem zdrowia publicznego. Według danych z różnych publikacji zależy to od przestrzegania pewnych zasad, szczepień, poprawy diagnostyki i terapii.

Diagnostyka na etapie zmian przedrakowych jest systematycznie poprawiana. Niestety jest ona naprawdę dobrze ukształtowana tylko w przypadku HPV-zależnego raka szyjki macicy. Dla raków HPV-zależnych występujących u mężczyzn, czy dla tych wspólnych dla kobiet i mężczyzn, rozwiązania dopiero powoli się pojawiają.

Terapia w przypadku raków HPV-zależnych jest bardzo trudna i prawie zawsze pozostawia trwały uszczerbek na zdrowiu. Niestety w Polsce, aż 50% raków szyjki macicy prowadzi do śmierci.

W części pierwszej:

Jak HPV przyczynia się do rozwoju niektórych raków i zmian przedrakowych?

Jak dochodzi do przejścia zmian przedrakowych w rakowe?

Szczególnie szczepienia wykonane przed zakażeniem pomagają zapobiec pojawieniu się stanów przedrakowych u wielu zaszczepionych lub przejściu ze stanu przedrakowego w raka.Czy szczepionki przeciw rakom HPV-zależnym chronią przed zakażeniem?

Jak jeszcze można sprawdzić bezpieczeństwo i skuteczność szczepień przeciw rakom HPV-zależnym? część 1 – Eksperyment Myślowy

Wiele ważnych informacji było przekazywanych również na łamach Eksperymentu myślowego dzięki wysiłkom profesor Agnieszki Szuster-Ciesielskiej.

Wirusy brodawczaków ludzkich (HPV) a rak szyjki macicy

Piśmiennictwo:

https://www.cancer.gov/news-events/cancer-currents-blog/2024/fda-hpv-test-self-collection-health-care-setting

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24108159

https://analyticalsciencejournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jssc.200800195

https://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/1886177

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25562266

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35860379

https://www.nature.com/articles/s41541-024-00914-z

Scientific approaches to defining HPV vaccine-induced protective immunity – PubMed

https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC10743582

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X23009908

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21973261

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24206418

https://www.mdpi.com/2076-393X/8/1/117

https://www.nature.com/articles/nrc.2018.13

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24108159

https://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/1886177

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468294223001028

https://academic.oup.com/jnci/article/116/6/857/7577291?login=false#no-access-message

https://www.thelancet.com/journals/lanepe/article/PIIS2666-7762(24)00347-8/fulltext

https://ourworldindata.org/hpv-vaccination-world-can-eliminate-cervical-cancer

https://www.fda.gov/files/vaccines,%20blood%20&%20biologics/published/Package-Insert—Gardasil.pdf

https://www.cdc.gov/mmwr/volumes/74/wr/mm7406a4.htm?s_cid=mm7406a4_w

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32997908

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32637895

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29280070

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29280070

https://www.bmj.com/content/370/bmj.m2930

https://www.bmj.com/content/372/bmj.m4931

https://www.thelancet.com/journals/lanpub/article/PIIS2468-2667(20)30010-4/fulltext

https://www.mdpi.com/2076-393X/10/3/419

https://www.mdpi.com/2076-393X/8/1/117

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/21645515.2022.2152256#d1e252

https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC6518966

https://www.mdpi.com/2076-393X/10/3/419

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0264410X18300525

Human papillomavirus (HPV) vaccines: Canadian Immunization Guide – Canada.ca

https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMsr2030640

https://ourworldindata.org/hpv-vaccination-world-can-eliminate-cervical-cancer

https://www.termedia.pl/ginekologia/Wysoka-wartosc-diagnostyczna-samobadania-w-kierunku-HPV-,58799.html

https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC7255493

https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa1612296

https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC3303646

https://www.thelancet.com/journals/lanonc/article/PIIS1470-2045(15)00229-6/fulltext

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X23009908

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12444178

https://www.canada.ca/en/public-health/services/publications/healthy-living/canadian-immunization-guide-part-4-active-vaccines/page-9-human-papillomavirus-vaccine.html

https://bmcbiotechnol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12896-015-0152-x

https://www.cancer.gov/news-events/cancer-currents-blog/2020/hpv-vaccine-prevents-cervical-cancer-sweden-study

https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC7655971

https://www.bmj.com/content/388/bmj-2023-078140.longhttps://www.cancer.gov/news-events/cancer-currents-blog/2024/fda-hpv-test-self-collection-health-care-setting

Autor (profesor Piotr Rieske) jest biotechnologiem i diagnostą laboratoryjnym (analitykiem medycznym). Przez wiele lat zajmował się diagnostyką medyczną, w tym nowotworów HPV-zależnych. Obecnie opracowuje testy diagnostyczne, głównie do zastosowania w onkologii. Zajmuje się między innymi immunoterapiami onkologicznymi i projektowaniem szczepionek terapeutycznych (a nie profilaktycznych) znajdujących zastosowanie w onkologii. Nie są to szczepienia dotyczące raków HPV-zależnych.

Publikacja nie jest poradą medyczną. Ma ona charakter popularno-naukowy.

Czy biotechnolodzy tworzą coś nowego, czy kradną naturze?

Piotr RieskeLeave a comment

Jak powiedział Picasso: „Dobrzy artyści kopiują, wielcy kradną.” Podobnie wyrażali się między innymi: Igor Stravinsky, T.S. Eliot czy Steve Jobs.

Te słowa nie są jednak pochwałą kradzieży, ale zachętą do pokory i szacunku wobec tych, którzy tworzyli coś wcześniej. Zachętą do przyznania, że coś stworzone wcześniej było co najmniej inspiracją dla kolejnych pokoleń artystów. Przykładem jest las Birnam z Makbeta Szekspira, który inspirował Tolkiena przy opisie ataku Entów (pasterzy drzew) na Isengard.

Czy biotechnolodzy kradną (plagiatują) w takim sensie? Podobnie, jak artyści obserwują efekty pracy innych artystów, również biotechnolodzy obserwują pracę innych biotechnologów. Pojęcie „patentów” w sztuce (poza muzyką) bywa trudne do zdefiniowania – nie patentuje się obrazów. W biotechnologii jest o patenty trochę łatwiej. Mimo to urzędy patentowe ze zmienną konsekwencją przyznają lub nie prawa patentowe (własności intelektualnej) kolejnym projektantom. Jednak biotechnolodzy i artyści „plagiatują” jeszcze inaczej. „Plagiatują” naturę, a ta nie pójdzie oczywiście do sądu. Okazuje się jednak, że ma ona swoich rzeczników w urzędach patentowych w kwestiach biotechnologicznych. Przez wiele lat w urzędach patentowych trwał wielki spór o to, na ile rozwiązania podpatrzone w naturze mogą być patentowane. Rzecznicy patentowi wyznaczyli pewne kryteria, po spełnieniu których patent zostanie przyznany. Natomiast, biorąc pod uwagę cytat z Picassa, wobec kogo czy czego taki „złodziej biotechnolog” powinien taki rodzaj szacunku okazać?

Przeciwciała, enzymy do testów PCR, plazmidy, wektory wirusowe, nagrodzony Noblem CRISPR, promotory, sekwencje nukleotydowe czy aminokwasowe i wiele innych „rzeczy”, „ukradli” wirusom i bakteriom (na końcu tekstu znajduje się glosariusz wyjaśniający używane terminy biotechnologiczne). Po co…? Wcześniej chociażby po to, by produkować białka terapeutyczne i diagnostyczne. Ostatnio wszystko to, czego trochę nakradli, składają jak klocki lego w zupełnie nowe twory terapeutyczne, nazywając to już nie biotechnologią, a biologią syntetyczną.

Plazmidy służą bakteriom do tworzenia np. białek antybiotykooporności. Biotechnolodzy zamienili te fragmenty DNA w plazmidach w transgeny do produkcji białek potrzebnych ludziom – chociażby do produkcji insuliny dla chorych na cukrzycę. Nie dość, że ukradli bakteriom pomysł, to jeszcze go wykorzystują do produkcji np. leków.

Polimerazowa reakcja łańcuchowa (PCR), która stała się powszechnie znana w czasie pandemii COVID-19, to również w pewnym sensie zasługa bakterii. Jedne z nich, aby żyć w gorących źródłach Yellowstone „wymyśliły” białka, w tym polimerazę, które są w stanie przetrwać w wysokich temperaturach, a to dzięki niej możliwe jest szybkie prowadzenie PCR. W czasie tej reakcji temperatura wielokrotnie osiąga ponad 90 stopni Celsjusza, a większość molekuł polimerazy nie może ulec denaturacji. Oczywiście biotechnolodzy – za pomocą plazmidów z transgenem – zmuszają zwykłe bakterie (głównie E.coli) do produkcji tej polimerazy. Kradną polimerazę z jednych bakterii, a inne zmuszają do niewolniczej produkcji.

Skąd się wzięła odwrotna transkryptaza potrzebna, aby przepisać RNA (wirusa takiego jak SARS-CoV-2) na DNA przed reakcją PCR? Również ona została „skradziona”, tym razem wirusom.

Technologia CRISPR, nagrodzona nagrodą Nobla w 2020 roku, służąca obecnie np. do naprawy uszkodzonych genów, wywodzi się z systemu bakteryjnego, którym bakterie zwalczają swoich wrogów, wirusy bakteryjne – bakteriofagi. Pierwsza terapia oparta o CRISPR do leczenia osób z chorobą genetyczną – chorobą sierpowatokrwinkową – została zarejestrowana przez FDA w 2023 roku. System, z którego wywodzi się CRISPR/Cas chroni bakterie przed ich wirusami – to „element układu odpornościowego bakterii”. Bakterie tworzą „biblioteki” fragmentów genomów fagowych, aby wtedy, kiedy któryś znowu zaatakuje, zniszczyć go. Tworzenie bibliotek fragmentów genomów fagowych w genomie bakteryjnym jest więc przez niektórych autorów określane mianem budowania pamięci immunologicznej. Natomiast biotechnolodzy wykorzystują CRISPR/Cas do naprawy genomu np. w ludzkich komórkach. Widać więc, że podpatrywanie natury miało miejsce, ale zastosowanie rozwiązania Cas9 z zaprojektowanym fragmentem RNA jest już zupełnie inne. Powstają kolejne metody edycji genomu, takie jak prime editing, w których podkrada się naturze coraz więcej. Nie wolno robić edycji genomu na poziomie komórek linii germinalnych czy komórek zarodkowych człowieka, ale wolno na poziomie komórek somatycznych (dojrzałych i multipotentnych macierzystych).

Rycina 1 Schemat odwzorowuje działanie systemu edycji genomu PE. Chimeryczne białko składa się ze zmutowanego Cas9 i odwrotnej transkryptazy. Mutacja Cas9 powoduje, że enzym rozcina tylko jedną nić dwuniciowego DNA. Odwrotna transkryptaza przepisuje sgRNA na DNA, które jest wykorzystywane przez system naprawy uszkodzeń DNA. Genom jest zmieniany zgodnie z instrukcją dostarczaną przez pegRNA (odmiana gRNA stosowana do edycji prime). Na podstawie ryciny z artykułu „Techniki edycji genomu jako narzędzie modyfikacji komórek układu odpornościowego” Alergologia Polska 2021 (za zgodą autorów Ewelina Stoczyńska-Fidelus, Piotr Rieske)

Biotechnolodzy równocześnie próbują wykorzystać również naturalnego wroga bakterii, jakim są bakteriofagi, po to, żeby bakterie zwalczać. Jest to szczególnie ważne wobec pojawiającej się antybiotykoodporności. Rozwiązanie takie zaczyna być stosowane w produkcji żywności, ponieważ stosowanie antybiotyków chociażby w uprawach roślin czy hodowli drobiu to jedna z głównych przyczyn pojawiania się antybiotykoodporności.

Jak widać, bardzo wiele systemów wykorzystywanych przez biotechnologów powstało w trakcie walki organizmów z ich patogenami. Co nie powinno dziwić, bo taka walka jest akceleratorem ewolucji, a zatem tworzenia coraz doskonalszych rozwiązań.

Nie jest to jednak jedyne źródło, z którego pozyskuje się narzędzia czy technologie.

Biotechnolodzy wykorzystują bakterie (np. Agrobacterium tumefaciens), aby tworzyć rośliny GMO. Normalnie bakterie te infekują rośliny i wprowadzają swoje geny, żeby pozyskiwać od roślin opiny.

Wektory wirusowe stosowane np. w terapii genowej to wykorzystanie ułomnych czynników infekcyjnych, które w formie kompletnej infekują np. komórki ludzi, a u biotechnologów infekują komórki, aby wprowadzić do nich to, co chcą w nich umieścić. Jeśli chcemy zastosować wspomniany wcześniej CRISPR/Cas, to także najczęściej wykorzystujemy wirusy jako wektory tego systemu. Jeśli chce się wprowadzić „transgen leczniczy”, to również tak to się odbywa.

Bakterie, aby walczyć z bakteriofagami, „wymyśliły” – podobnie (jak CRISPR/Cas) – enzymy restrykcyjne. Biotechnolodzy korzystają z nich notorycznie, aby tworzyć wektory do produkcji np. białek leczniczych. Paradoksalnie system, który miał chronić bakterie przed ingerencją w ich DNA, służy do zmieniania ich DNA plazmidowego.

Bakteriofagi posiadają natomiast specjalne rekombinazy, umożliwiające wprowadzanie ich genów do genomu bakterii. Biotechnolodzy zastąpili tym systemem fagowym enzymy restrykcyjne, aby skonstruować/wygenerować system gate way – bramkowania − i szybciej przenosić między plazmidami np. transgeny lecznicze.

Biotechnolodzy w ogóle bardzo często korzystają z rozwiązań powstających w trakcie ewolucji wirusów. Genomy wirusów są bardzo małe, gdyż od upakowania na małej przestrzeni wielu informacji zależy ich przetrwanie. Biotechnolodzy również muszą upakowywać dużo informacji na małej przestrzeni, co wynika z niuansów technicznych ich pracy.

Wirusy „wymyśliły” więc np. sekwencję IRES, która pozwala otrzymywać z jednego fragmentu mRNA coś, co u eukariotów jest kodowane przez kilka genów. Wirusy geny zastąpiły czymś, co nazywa się otwartymi ramkami odczytu. Nie ma potrzeby, żeby kontrolować pojawianie się białek wirusowych w tak skomplikowany sposób, jak np. w komórkach człowieka. Zazwyczaj wszystkie białka wirusowe mogą, a nawet powinny pojawiać się równocześnie, aby doszło do samoskładania wirionów. W przypadku komórek człowieka tak nie jest. Istnieje wąska specjalizacja. To między innymi dzięki temu, pomimo że w każdej komórce jednego człowieka jest w zasadzie ten sam genom, mamy ponad 200 rodzajów komórek.

Podobnie jak IRES, peptydy (sekwencje) F2A czy P2A pozwalają wirusom na tworzenie wielu białek z jednej cząsteczki mRNA. Biotechnolodzy „plagiatują” te rozwiązania, aby również otrzymywać kilka białek z jednego fragmentu RNA. W tym przypadku rybosom po zakończeniu translacji jednego białka przeskakuje niejako do translacji następnego. IRES pozwala przyłączać się rybosomom w kilku miejscach mRNA i inicjować translację.

Wirusy regulują transkrypcję (przepisywanie DNA na RNA) za pomocą bardzo małych fragmentów regulacyjnych i w ten sposób wymuszają produkcję swojego RNA w komórkach ssaków. Te małe elementy regulacyjne z wirusów SV-40 czy CMV również zostały wykorzystane przez biotechnologów.

Oczywiście nie wyczerpuje to wszystkich elementów, które są plagiatowane z organizmów żywych przez biotechnologów.

Ponadto nie wszystkie rozwiązania pochodzą ze świata patogenów.

Przeciwciała wykorzystywane np. w diagnostyce normalnie służą do zwalczania patogenów. Biotechnolodzy wytwarzają je do: testów onkologicznych, wirusowych (kupujemy je w aptece), a nawet do testów ciążowych. To rozwiązanie układu odpornościowego różnych zwierząt. Ostatnio plagiatują je np. od alpak, ale również od rekinów, gdyż te mają dość sprytne (bardzo małe) przeciwciała.

Szczepionki to również zaprzęgnięcie do działań człowieka naturalnego systemu odpornościowego. Do ich tworzenia wykorzystywane są plazmidy, wektory wirusowe itp., opisane wcześniej. W naturze cena nabywania odporności jest bardzo wysoka. Często jest to kalectwo, niekiedy śmierć członków społeczności.

Przeciwnowotworowa terapia CAR-T jest wspólnym dziełem natury, biotechnologów i immunologów. Polega na połączeniu odpowiedzi limfocytów T i limfocytów B. Skradziono więc układowi odpornościowemu dwa rozwiązania i stworzono ich funkcyjną chimerę przy okazji tworzenia chimerowego białka. Powstała komórka, która nie wymaga prezentowania antygenu na cząsteczkach HLA (MHC), ale rozpoznająca go bezpośrednio. Pozwala to uniknąć niektórych działań, komórek nowotworowych, których one dokonują, aby „zmylić” układ odpornościowy. Litera C w nazwie CAR-T pochodzi właśnie od chimerowy (ang. chimeric).

CAR-T to przykład nowego świata biotechnologii, czyli biologii syntetycznej. W tym świecie biotechnolodzy tworzą nowe byty np. komórkowe, ale również kradną istniejące w przyrodzie elementy regulatorowe, białka itp. Również białka używane do edycji (naprawiania) genów w ramach metod nowocześniejszych niż CRISPR, takich jak prime editing, to białka chimerowe. Podbieranie elementów ze świata przyrody to pierwszy etap. Kolejny − to tworzenie z nich nowych, nieistniejących w przyrodzie bytów, takich jak komórki. Układy te są na tyle skomplikowane, że zaczyna się je porównywać do układów scalonych. Jest to dość luźna analogia, ponieważ komórka ma inną organizację przestrzenną niż układ scalony, ale obrazuje złożoność zmian, które biologia syntetyczna oferuje.

Na czym więc bardzo często polega biotechnologia czy biologia syntetyczna? Polega na podpatrywaniu natury i wykorzystywaniu jej wynalazków w innych celach niż te, dla których natura je wytworzyła. Sposoby korzystania z tych wytworów stają się coraz bardziej wyrafinowane. Najczęściej korzysta się z tego, co powstało w ramach ewolucyjnego wyścigu zbrojeń między bakteriofagami, a bakteriami, czy między naszym układem odpornościowym, a patogenami.

Rycina 2 Opis CAR-T w glosariuszu. W skrócie: komórki CAR-T atakują komórki nowotworowe i prowadzą do ich śmierci. CAR-T otrzymuje się dzięki metodom inżynierii genetycznej. W tym celu wykorzystuje się rozwiązania opisane w tekście: wektory wirusowe, transgen, którego transkrypcja regulowana jest np. promotorem CMV itp. Zmodyfikowane na podstawie materiału z BPS Bioscience CAR-T Cell Therapy (bpsbioscience.com).

Glosariusz z wyjaśnieniami ( w celach popularyzacji)

PCR − łańcuchowa reakcja polimerazy, PCR (od ang. polymerase chain reaction)

Metoda powielania dwuniciowych fragmentów DNA. W trakcie reakcji odbywa się od 25 do 40 cykli, w czasie których dochodzi do kopiowania wybranego fragmentu DNA temperatura zmienia się od 45 do 95 stopni Celsjusza.

Odwrotna transkryptaza

Polimeraza DNA zależna od RNA, umożliwia syntezę nici DNA, wykorzystując jako matrycę RNA. Enzym ten w naturze kodowany jest w otwartych ramkach odczytu retrowirusów. Proces, w którym bierze udział ten enzym, nosi nazwę odwrotnej transkrypcji.

Metoda CRISPR/Cas (ang. Clustered Regularly−Interspaced Short Palindromic Repeats, pol. zgrupowane, regularnie rozproszone, krótkie, powtarzające się sekwencje palindromiczne)

Metoda ta pozwala na edycję genomu organizmu, który posiada odpowiedni system naprawy uszkodzeń DNA (Eukaryota). Mechanizm immunologiczny, z którego wywodzi się ta metoda: u bakterii odpowiedni RNA umożliwia niszczenie genomu fagów dzięki enzymom Cas. Enzymy Cas rozcinają DNA bakteriofagów rozpoznany przez to RNA. Biotechnolodzy wprowadzają transgen kodujący sgRNA, przypominający funkcyjnie RNA z bakteryjnego CRISRP razem z transgenem kodującym Cas (najczęściej Cas9), do komórek eukariotycznych. W tych komórkach, w przeciwieństwie do komórek prokariotycznych, może dochodzić do naprawy uszkodzeń DNA, powodowanych przez Cas9 naprowadzony przez sgRNA na odpowiednie miejsce DNA. sgRNA jest kodowany oddzielnym transgenem regulowanym przez promotor taki jak np. U6 (przyłącza on odpowiednią polimerazę). Sekwencja CRISPR w naturze zawiera fragmenty genomów bakteriofagów, które bakteria wcześniej zwalczyła. Dlatego CRISPR to część systemu ochrony przed bakteriofagami. Na tym przykładzie widać, jak bardzo biotechnolodzy zmieniają pierwotne zastosowanie jakiegoś rozwiązania działającego w naturze.

PE prime editing − zastosowanie edycji prime

Metoda wywodzi się z CRISPR/Cas. Wykorzystuje się w niej jednak białko chimerowe mutanta Cas9 (H840A) połączone z domeną odwrotnej transkryptazy. Powstało pięć (a nawet siedem, uwzględniając NPE i TPE) kolejnych odmian tej metody. Metoda pozwala na uniknięcie niektórych błędów pojawiających się w czasie edycji genomu metodą CRIPSR/Cas tzw. INDELS niechciane insercje, delecje.

Sekwencje 2A (F2A, P2A)

Sekwencje kodujące peptydy 2A pochodzą z genomów wirusowych. Umieszczenie ich pomiędzy sekwencjami DNA (potem RNA) kodującymi dwa różne białka powoduje, że rybosom w czasie translacji po ukończeniu syntezy pierwszego białka niejako przeskakuje do syntezy następnego białka. W ten sposób biotechnolodzy mogą umieścić w wektorach sekwencje kodujące więcej niż jedno białko − transgen(y)/otwarte ramki odczytu, których ekspresja jest regulowana przez jeden promotor.

IRES

Skrót pochodzi od ang. internal ribosome entry site. To element RNA pozwalający inicjować translację w sposób niezależny od czapeczki mRNA 5’. IRES pozwala rybosomom zacząć syntezę w kilku miejscach jednego fragmentu (jednej molekuły) mRNA. W przeciwieństwie do P2A, IRES umożliwia startowe przyłączenie rybosomu w miejscu, gdzie występuje sekwencja charakteryzująca ten fragment RNA. Peptyd 2A ujawnia swój efekt, kiedy dojdzie do translacji białka zakończonego tą sekwencją peptydową. Wtedy ten rybosom, który ten fragment zsyntetyzował, podejmie syntezę kolejnego białka dzięki temu, że molekuła RNA, na której się znajduje, zawiera sekwencję kodującą kolejny peptyd.

Promotor SV-40, promotor CMV

Rozpoczęcie transkrypcji (proces syntezy RNA na matrycy DNA) u ssaków jest precyzyjnie regulowane. Wirusy DNA wykorzystują krótkie sekwencje, aby ten proces uruchomić. Do tych fragmentów DNA przyłączają się czynniki transkrypcyjne, do których przyłącza się polimeraza RNA. Popularne wśród biotechnologów ze względu na niewielki rozmiar są fragmenty (sekwencje) pochodzące z wirusów SV-40 i CMV.

CAR-T

Skrót określający limfocyty T, do których metodami inżynierii genetycznej wprowadzono transgen kodujący białka CAR, ang. chimeric antigen receptor). Białko to składa się z kilku domen, które bez ingerencji człowieka należą do kilku białek. W typowym CAR jest to domena scFv (ang. single-chain variable fragment) i domeny należącej do białek, które w limfocytach T transdukują (przekazują) sygnał umożliwiający zabijanie np. komórek zainfekowanych przez wirusa (CD28, 4-1 BB, CD3z itp). Typowy scFv to fragment zmienny łańcucha lekkiego i ciężkiego konkretnego przeciwciała połączony odpowiednim peptydem/linkerem. Takie działanie pozwala komórkom CAR-T eliminować komórki nowotworowe, które wykazują ekspresję genu kodującego białko rozpoznawane przez domenę scFv. Same przeciwciała nie wykazują takiej skuteczności jak CAR-T. Analogicznie skrót CAR-M będzie oznaczał makrofagi, do których wprowadzono transgen kodujący białko CAR.

Transgen, gen, otwarta ramka odczytu (ORF)

Określenie transgen zostało zarezerwowane w tym tekście dla sekwencji kodujących umieszczanych w odpowiednich wektorach przez człowieka. Natomiast gen tutaj to fragment genomu kodujący białko czy RNA, który powstał w naturze. Autor zdaje sobie sprawę że gen bakteryjny w plazmidzie (nie chromosomie bakteryjnym) nie różni się zasadniczo od transgenu bakteryjnego. Zdecydowano się jednak na rozróżnienie gen vs. transgen, ponieważ większość fragmentów kodujących umieszczanych w wektorach np. wirusowych, a opisanych w tym tekście, odnosi się do genomu człowieka. W przypadku Eukaryota ekspresja genu jest regulowana za pomocą promotora, wzmacniaczy, wyciszaczy, a pierwotny transkrypt ulega splicingowi. Transgen takiego genu ma natomiast sztuczny względem oryginalnego promotor (patrz promotor CMV/SV40), co zmienia sposób regulacji jego ekspresji. Gen u eukariotów położony jest w konkretnym miejscu genomu, transgen tego genu wprowadzony do genomu ludzkiego za pomocą np. wektorów wirusowych zazwyczaj ma położenie przypadkowe. Te różnice powodują np., że edycja genomu (konkretnego genu) w celach terapeutycznych jest rozwiązaniem bardziej pożądanym niż tradycyjna terapia genowa oparta o transgen. Różnic między genem a transgenem jest więcej. Termin otwarta ramka odczytu (ang. open reading frame ORF), został tu użyty w odniesieniu do genomów wirusowych i transgenów. W przypadku genomu wirusa jedna molekuła mRNA dostarcza kilku otwartych ramek odczytu − fragment kwasu nukleinowego wirusa, na bazie którego powstaje jedna cząsteczka mRNA koduje kilka białek. W tekście użyto tych trzech określeń dla fragmentów kwasów nukleinowych kodujących głównie białka. Gen czy transgen nie musi jednak kodować białka. Jak wskazano, sgRNA używane w metodzie CRISPR, czy PE (pegRNA), jest również kodowane przez transgen. W wektorach przygotowywanych przez biologów również pojawiają się odcinki DNA kodujące mRNA dla kilku białek właśnie dzięki wykorzystaniu rozwiązań pochodzących z genomów wirusowych.

Fizjologia smaku, czyli dlaczego jedne rzeczy nam smakują, a inne nie (1)

Marcin Czerwiński3 komentarze

Tomasz Kubowicz niedawno napisał o najbardziej gorzkiej substancji na świecie, za jaką uważa się Bitrex. Ale jak to jest, że czujemy gorzki smak? I dlaczego możemy czuć różne smaki? Postaram się to wyjaśnić we wpisie poniżej.

Dlaczego czujemy smak?

Za odczuwanie smaku odpowiadają kubki smakowe, które znajdują się głównie (chociaż nie tylko) w jamie ustnej. Każdy kubek smakowy zawiera wyspecjalizowane komórki, które po związaniu jakiejś substancji chemicznej (np. glukozy) uruchomiają przekazanie sygnału do mózgu. Jeżeli w ustach zmienia się stężenie soli lub jonów wodorowych, to zmiany te również są wykrywane przez odpowiednie komórki obecne w kubkach smakowych.

Kubki smakowe i brodawki smakowe

Kubki smakowe znajdują się w nabłonku wielu narządów, chociaż najwięcej ich wchodzi w skład brodawek znajdujących się na języku. Można powiedzieć, że język jest głównym organem wyczuwającym smak. Brodawki językowe sprawiają, że powierzchnia języka jest szorstka. Istnieją cztery rodzaje brodawek językowych: nitkowate, grzybopodobne, liściaste i obwodowe. Brodawek nitkowatych jest najwięcej; odpowiadają one za mechaniczną stymulację języka, przewodzą impulsy bólowe, ale nie zawierają kubków smakowych. Te są obecne w pozostałych trzech rodzajach brodawek.

Brodawki grzybopodobne znajdują się na grzbietowej części języka, a najwięcej ich jest na jego przedniej części. Jest ich w sumie około 200. Zawierają ok. 25% wszystkich kubków smakowych.

Brodawki liściaste znajdują się na bocznej stronie języka. Jest ich nie więcej niż 5 po każdej stronie. Zawierają ok. wszystkich 25% wszystkich kubków smakowych.

Brodawki obwodowe znajdują się na tylnej części języka. Jest ich 8 – 12. Zawierają ok. 50% wszystkich kubków smakowych.

Każda brodawka może zawierać od kilku do ponad 100 kubków smakowych. W sumie kubków smakowych mamy ok. 4000 (na pewno nie więcej niż 8000). I to właśnie one powodują, że czujemy smak tego, co jemy (Ryc. 1).

Ryc. 1. Rozmieszczenie brodawek na języku oraz schemat budowy kubka smakowego. Według: Jaime-Lara R.B. et al., Physiol. Rev. 2023, 103: 855–918. Licencja CC BY 4.0.

Receptory smakowe

Każdy kubek smakowy zawiera 150 – 300 komórek receptorowych, a każda komórka receptorowa zawiera tylko jeden typ receptora. Receptorami mogą być kanały jonowe lub receptory związane z białkiem G (G protein-coupled receptors, GPCR). Te ostatnie to duża rodzina białek transmembranowych (czyli znajdujących się w błonie komórkowej). Białka te po związaniu zewnątrzkomórkowego liganda (czyli czynnika, który jest swoiście rozpoznawany) powodują aktywację białka G, polegającą na zastąpieniu GDP przez GTP (odpowiednio, gunazyno-5’-difosforan i guanozyno-5’-trifosforan). Tak zaktywowane białko G może aktywować inne białka, w tym cyklazę guanylową, co powoduje przesłanie sygnału do komórki, co z kolei skutkuje zmianami w metabolizmie. Jest wiele receptorów związanych z białkiem G, należą do nich m.in. receptory dla adrenaliny, serotoniny czy opioidów. Większość receptorów smakowych też należy do tej rodziny.

Drugim rodzajem receptorów smakowych są kanały jonowe. Są to również białka transmembranowe, a ich rolą jest przenoszenie jonów przez błonę komórkową. 

Ile smaków możemy wyczuć? Do niedawna uważano, że podstawowych smaków jest pięć: słony, słodki, gorzki, kwaśny i umami (z japońskiego „smakowity”). Dziś uważa się, że jest jeszcze szósty smak, który można nazwać tłustym, czyli związanym z obecnością tłuszczów. Każdy z tych smaków rozpoznawany jest przez określony typ komórki, która ma na powierzchni odpowiednie receptory. Ponieważ smaków jest sześć, to jest również sześć typów komórek receptorowych. Samych receptorów jest jednak więcej, bo o ile np. smak kwaśny jest rozpoznawany tylko przez jeden typ receptora, to smak gorzki przez 25 rodzajów (o czym piszę w dalszej części).

Receptory te są pokazane na Ryc. 2. Białka typu GPCR odpowiadają za wyczuwanie smaków: słodkiego, gorzkiego, umami i tłustego (częściowo, bo smak tłusty ma jeszcze drugi rodzaj receptora, którym jest kanał jonowy). Kanały jonowe odpowiadają za wyczuwanie smaku kwaśnego, słonego i tłustego (drugi receptor).

Poniżej krótka charakterystyka receptorów dla poszczególnych smaków.

Smak kwaśny

Kanał jonowy Otop1 (otopterin 1) jest białkiem, które przenosi jony wodorowe przez błonę komórkową. Jeżeli w ustach mamy dużo jonów wodorowych (czyli pH jest niskie), białko Otop1 przepuszcza je do wnętrza komórki, co powoduje wysłanie sygnału do mózgu, że mamy w ustach coś kwaśnego. Tu ciekawostka: każdy chemik zauważy, że o ile możemy wykrywać kwaśny smak powodowany przez jony wodorowe (H+), to nie mamy receptora dla jonów hydroksylowych (OH–). Dlatego substancje o zasadowym pH (np. mydło) wydają się nam obrzydliwe.

Smak słony

Kanały jonowe o nazwach ENaC i TRPV1 przenoszą jony sodowe przez błonę komórkową i odpowiadają za wyczuwanie smaku słonego. Ten drugi jest również receptorem dla kapsaicyny, czyli piekącej substancji zawartej w papryczkach chili. Kapsaicyna aktywuje więc po części receptory smaku słonego, co pozwala na zastąpienie szkodliwej w nadmiarze soli przez ostre przyprawy (uwaga dla kucharzy).

Smak tłusty

Białko o nazwie CD36 należące do rodziny kanałów jonowych przenosi kwasy tłuszczowe do wnętrza komórki i wspólnie z białkiem GPR120 (które należy do rodziny GPCR) odpowiada za wyczuwanie tłuszczów w pokarmie. Ściśle rzecz biorąc, nie wyczuwamy tłuszczów, ale wchodzące w ich skład kwasy tłuszczowe. Reakcję hydrolizy tłuszczów do glicerolu i kwasów tłuszczowych przeprowadzają obecne w ślinie enzymy z rodziny lipaz.

Smak słodki i umami

Smak słodki znamy wszyscy, ale czym jest smak umami? Został odkryty przez japońskiego badacza Kikunae Ikedę, który w 1908 r. zauważył, że smak bulionu z wodorostów różni się od podstawowych czterech smaków. Nazwał go „umami”, co po japońsku znaczy „esencja pyszności”. Przeprowadzone przez niego analizy chemiczne wykazały, że za ten smak odpowiada kwas glutaminowy, który jest jednym z podstawowych aminokwasów. Dziś jego sól sodowa (lub potasowa albo magnezowa) jest stosowana powszechnie jako wzmacniacz smaku i możemy ją znaleźć w większości przetworzonych produktów spożywczych (kody E620-E625).

Za wykrywanie smaku słodkiego i umami odpowiadają kompleksy złożone z dwóch białek. W ich skład wchodzi zawsze białko T1R3 oraz białko T1R2 (dla smaku słodkiego) lub T1R1 (dla umami). Tylko obecność obu białek jednocześnie powoduje, że możemy wyczuć te smaki. U kotów miała miejsce mutacja w genie kodującym receptor T1R2; białko kodowane przez taki gen jest defektywne (brakuje długiego fragmentu) i nie może dalej przekazywać sygnału. Dlatego koty nie lubią słodyczy. Przypuszczalnie smakują im trochę tak, jak nam mydło.

Ryc. 2. Receptory smaku i niektóre cząsteczki, które je aktywują. Według: Jaime-Lara R.B. et al., Physiol. Rev. 2023, 103: 855–918. Licencja CC BY 4.0.

Smak gorzki, czyli jak uniknąć trucizn

Wśród receptorów smaku najwięcej jest receptorów smaku gorzkiego: jest ich cała rodzina o nazwie T2R (używa się też nazwy TAS2R). U człowieka znanych jest 25 genów kodujących funkcjonalne receptory smaku gorzkiego, ale płazy mają ich ok. 60, a gady 40. U ssaków bywa różnie, najwięcej mają ich zwierzęta wszystkożerne i roślinożerne (np. krowa 22, mysz 36), a najmniej mięsożerne (np. fretka 12, niedźwiedź polarny 14, pies 16). Dlaczego receptorów dla gorzkiego smaku jest aż tyle? Chronią przed zatruciem, ponieważ większość trucizn ma gorzki smak. Im więcej receptorów i im bardziej są one zróżnicowane, tym większa szansa, że wykryjemy dany rodzaj trucizny, bo dana substancja może aktywować tylko jeden rodzaj receptora. A jakie organizmy są największym producentem trucizn? Rośliny, które w ten sposób bronią się przed zjadaniem. Dlatego zwierzęta roślinożerne mają najwięcej rodzajów receptorów gorzkiego smaku.

Fenylotiokarbamid jako test na gorzki smak

Przykładem gorzkiej substancji wykrywanej przez jeden rodzaj receptora jest fenylotiokarbamid (PTC). W 1931 r. Arthur Fox, chemik z firmy Du Pont, przypadkowo wypuścił w powietrze chmurę kryształków tego związku i zauważył, że o ile jego koledzy uskarżali się na jego gorzki smak, to on sam nie czuł nic. Szersze badania wykazały, że niezdolność do wykrywania gorzkiego smaku PTC jest cechą recesywną (to znaczy, trzeba mieć dwa takie allele żeby taka cecha miała miejsce). Ok. 30% ludzi ma taką cechę (angielskie określenie: „non-taster”), czyli nie czuje gorzkiego smaku PTC. Przyczyną jest mutacja w genie T2R38 (jednym z genów kodujących receptory smaku gorzkiego), która powoduje, że białko jest nieaktywne i po związaniu cząsteczki nie może przesyłać sygnału do mózgu. Osoby, które mają taką mutacje w obu allelach tego genu, nie czują też limoniny, która nadaje gorzki smak cytrusom (najwięcej jest jej w grejpfrutach). Są też udokumentowane związki między takimi mutacjami i zamiłowaniem do niektórych warzyw o gorzkim smaku, ale o tym napiszę w następnym odcinku (Ryc. 3).

Ryc. 3. Fenylotiokarbamid (PTC). Źródło: Wikipedia, domena publiczna.

Trucizny i receptory dla nich

Jakie substancje mają gorzki smak i jakie receptory je rozpoznają? Chinina, niezwykle gorzka substancja (nieszkodliwa w niewielkich, ale trująca w dużych ilościach) jest rozpoznawana przez białka T2R39 i T2R46. Amigdalina, trujący związek obecny m.in. w pestkach brzoskwiń i morel, jest rozpoznawana przez białko T2R16. Pisał o niej Lucas Bergovsky.

Strychnina, silnie trujący związek o bardzo gorzkim smaku, jest rozpoznawana przez receptor T2R46. Ale np. silnie trująca solanina z ziemniaka nie jest rozpoznawana przez żaden z ludzkich receptorów, i w związku z tym w zasadzie nie ma smaku. Zatrucia solaniną zdarzają jednak się rzadko, bo bulwy ziemniaka przeważnie jej nie zawierają (pisał o tym Mirosław Dworniczak).

Wśród roślin uprawianych przez człowieka na duża skalę jedna może być naprawdę niebezpieczna: jest to maniok jadalny (Manihot esculenta). Pochodzi z Brazylii, a dziś uprawiany jest powszechnie w Afryce i spożywany w postaci mąki zwanej tapioką lub kassawą (Ryc. 4).

Ryc. 4. Bulwy manioku. Źródło: Wikipedia, David Monniaux. GNU Free Documentation License.

Maniok zawiera dwa gorzkie alkaloidy o nazwach linamarina i lotaustralina, które zapewniają ochronę wobec szkodników. Podobnie jak w amigdalinie są w niej grupy nitrylowe, które mogą uwalniać cyjanowodór. Związków tych można się pozbyć w wyniku gotowania lub pieczenia, a także po 24-godzinnym wymoczeniu w  wodzie. Pomimo to, zatrucie alkaloidami zawartymi w manioku zdarza się dość często i powoduje chorobę o nazwie konzo (w Afryce co najmniej 100 000 przypadków rocznie). Objawy to uszkodzenie nerwów ruchowych (w języku Yaka konzo to „związane nogi”) i postępujący paraliż. Wiele zależy tu od indywidualnej zdolności wyczuwania gorzkiego smaku: jedne osoby czują go lepiej, a inne gorzej, i to właśnie one bardziej narażone są na zatrucie (Ryc. 5).

Ryc. 5. Pacjenci z objawami konzo w Demokratycznej Republice Kongo (A) i zawartość trujących glikozydów w manioku jako funkcja zdolności do wyczuwania gorzkiego smaku przez różne osoby (B). Źródło: Wooding S.P. et al., Evol. Medicine Pub. Health 2021, 9: 431-447. Licencja CC BY 4.0.

I tu przechodzimy do indywidualnych zdolności percepcji smakowych, czyli do genetyki smaku. Ale o tym, a także o rzekomej „mapie języka”, opowiem w następnych odcinkach.

Literatura dodatkowa

Molekularne podstawy smaku:

https://doi.org/10.1152/physrev.00061.2021

Genetyczne różnice w wyczuwaniu smaku:

https://doi.org/10.1146/annurev-food-032519-051653

Słodki smak u kotów

https://doi.org/10.1093/jn/136.7.1932S

Gorzki smak i jego znaczenie

https://doi.org/10.1093/emph/eoab031