Zanosi się na progres w terapii pacjentów z chorobami genetycznymi. Lekarze w Filadelfii zastosowali eksperymentalną terapię u chłopca z rzadką genetyczną chorobą metaboliczną – niedoborem syntazy karbamoilofosforanowej typu I (CPS1). Z jednej strony podejście było bardzo personalizowane – dla jednego pacjenta. Z drugiej strony wytyczono pewien sposób postępowania, z którego zapewne spróbują skorzystać zespoły zajmujące się terapiami osób z różnymi chorobami dziedzicznymi. Przynajmniej tymi terapiami, które dotyczą wad komórek wątrobowych. Sukces ogłoszono piętnastego maja tego roku.

Kilka dni później przekazano informację o tym, że po raz pierwszy z sukcesem zastosowano inną metodę edycji genomu – edycję Prime. Dokonano tego u nastolatka z przewlekłą chorobą ziarniniakową. Była to odmiana tej choroby, w której dochodzi do mutacji genu NCF1.

W opisanej terapii użyto modyfikację techniki CRISPR. ABE (edytor zasad adeninowych). Rycina jest jedynie symboliczna.

Diagnoza i pierwsze prognozy dla dziecka z niedoborem CPS-1

Chorobę zdiagnozowano u dziecka wkrótce po narodzinach (chłopiec KJ Muldoon). Jej szybkie zdefiniowanie zależało od zastosowania takich technik jak sekwencjonowanie następnej generacji. Szybkiej diagnozy dokonano dzięki badaniom biochemicznym. Wykryto bardzo wysokie stężenie jonów amonowych, a stężenie cytruliny, która powstaje w cyklu mocznikowym było praktycznie nieoznaczalne. Gen kodujący enzym CPS1, ulega ekspresji w komórkach wątroby. Należy do enzymów prowadzących reakcje w ramach tzw. cyklu mocznikowego enzymów odpowiadających za eliminację jonów amonowych (NH4+). Jony amonowe w pewnym sensie stają się częścią mocznika, który jest o wiele mniej toksyczny. Są one bardzo toksyczne właśnie dla mózgu. Powstają jako produkt uboczny wykorzystywania aminokwasów do produkcji np. energii. Białka, które składają się jak wiadomo właśnie z aminokwasów, są potrzebne również jako budulec. Nie można więc wyleczyć takiego dziecka dietą. Można jedynie przejściowo łagodzić objawy. W przypadku niedoboru CPS1 śmiertelność wynosi 50%. Dotychczas terapią w przypadku tego niedoboru był przeszczep wątroby. Jeśli nawet udawało się znaleźć dawcę i uniknąć śmierci, często dochodziło do uszkodzeń mózgu, zanim przeprowadzono transplantację.

Walka o życie dziecka w oczekiwaniu na terapię CRISPR

Lekarze chłopca Rebecca Ahrens-Nicklas i Kiran Musunuru, poświęcili dużą część swojej działalności medycznej chorobom rzadkim związanym z cyklem mocznikowym. Prowadzili również badania dotyczące hipercholesterolemii rodzinnej. W tej chorobie wątroba jest również bardzo ważna. Zespołem biotechnologicznym kierował prawdopodobnie Barry J. Gertz. W oczekiwaniu na terapię CRISPR dziecko leczono uznanymi metodami. Stosowano między innymi terapię nerkozastępczą i związek chemicznych oczyszczający z jonów NH4+. Ogólnie leczenie było bardzo trudne. Chłopiec przeszedł w tym czasie ciężką infekcję. Można śmiało napisać, że lekarze walczyli o jego życie, a zespół naukowy każdego dnia walczył z czasem („no one was sleeping” ). Prawdopodobnie jeśli terapię zastosowano by 2-3 miesiące później, to byłoby już za późno by uniknąć poważnych zmian w mózgu dziecka, jeśli nie śmierci.

Udoskonalona terapia CRISPR

Zastosowano udoskonaloną metodę terapii genetycznej, za którą przyznano nagrodę Nobla w 2020 roku – edycję genomu CRISPR ( ang. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats). Dlatego pisze się w tym przypadku o terapii in vivo. Chłopiec leczony z niedoboru CPS1 miał (w niektórych komórkach nadal ma) dwie różne mutacje odziedziczone od każdego z rodziców (w każdym z alleli inną). Można mówić o pewnych pechu. KJ Muldoon ma troje rodzeństwa u którego choroba nie występuje. Choroba jest autosomalna recesywna. Szansa na urodzenie dziecka chorego wynosi 25%. Oczywiście jeśli rodzice są nosicielami. Naprawa obydwu alleli wymagała odpowiedniej adaptacji CRISPR. Zastosowano CRISPR ABE (ABE od angielskiego adenine base editor), by wymienić nukleotydy zmutowane na prawidłowe. Obydwie mutacje, które odziedziczył chłopiec sprzyjały wyborowi ABE. Były to: c.1003C→T (p.Gln335Ter, allel ojcowski) i c.2140G→T (p.Glu714Ter, allel matczyny).

Jest to pierwszy dowód progresu osiągniętego dzięki tej technologii. Czym innym jest bowiem stosowanie edycji genomu (np. CRISPR), aby dokonywać delecji fragmentów genu, a czym innym zastępowanie nieprawidłowych nukleotydów (fragmentów DNA) prawidłowymi i to jeszcze w dwóch różnych miejscach genu, na dwóch allelach w organizmie chorego.

Nowe podejście w metodzie dostarczania molekuł terapeutycznych

Co ważne, molekuły do edycji („naprawy”) uszkodzonego genu zostały dostarczone wprost do organizmu dziecka (jego komórek), za pomocą nanolipidów. Podano je dożylnie. Zapewniono również odpowiednią kompozycję i ładunek nanolipidów tak, żeby preferencyjnie trafiały do wątroby. Wątroba jest ogólnie filtrem do którego w takiej sytuacji trafi wiele molekuł. W odróżnieniu od wcześniejszych zatwierdzonych terapii (choroby sierpowatokrwinkowej, beta talasemii), w których wykorzystano CRISPR, nie modyfikowano komórek macierzystych w laboratorium. Nie poddawano komórek pacjenta z niedoborem CPS1 modyfikacjom poza jego organizmem (ex vivo), by tak naprawione wprowadzić mu je zwrotnie.

Dlaczego nie zrobiono tak jak w przypadku choroby sierpowatokrwinkowej? Wtedy zmieniono hematopoetyczne komórki macierzyste (komórki krwiotwórcze). Tymi komórkami macierzystymi naukowcy posługują się od lat. W przypadku wątroby jest to o wiele trudniejsze. Nie mamy takiej wiedzy o komórkach macierzystych wątroby.

Biotechnolodzy coraz łatwiej otrzymują i modyfikują genetycznie, indukowane pluripotentne komórki macierzyste (iPSc), z których powstają dowolne komórki organizmu. Podanie ich nie gwarantuje jednak, że wprowadzone do organizmu zróżnicują się (przeobrażą się) właśnie do komórek wątroby (hepatocytów). W przypadku mutacji genu, który ulega ekspresji w komórkach wątroby zastosowana terapia in vivo wydaje się więc optymalna.

Niektóre informacje jak np. to ile komórek zostało „naprawionych” u dziecka, nie mogą być na razie pozyskane ze względu na ryzyko, na które narażono by chłopca w czasie takich analiz. Nie wiadomo więc dokładnie jakie komórki i w jakim odsetku zostały „naprawione”. Zapewne są wśród nich hepatocyty, w których gen kodujący CPS1 ulega ekspresji (enzym ten jest w nich produkowany). Gwarantuje to kompozycja nanolipidów i podanie dożylne, po którym wątroba wychwytywała ich większość. Badania na specjalnie przygotowanym modelu zwierzęcym, które wykonano wcześniej, by uzyskać zgodę FDA wykazały natomiast, że naprawie u myszy ulec mogło nawet 40% hepatocytów. Za przygotowanie zwierząt w błyskawicznym tempie odpowiadało laboratorium Jackson. Końcowy sukces zależał od specjalistów reprezentujących różne dziedziny.

Nie wszystko jest tu takie różowe dla KJ Muldoona

Terapia CRISPR jak na razie jest u chłopca skuteczna, ale naukowcy i lekarze ostrzegają przed entuzjazmem. Wskazują na różne potencjalne problemy. Przykładowo na to, że pojawienie się po terapii u chorego białka, którego wcześniej jego komórki nie produkowały, może mieć paradoksalnie również niekorzystne konsekwencje. Będzie to bowiem białko w pewnym sensie obce dla układu odpornościowego chłopca. Takie będą przynajmniej jego fragmenty. Akurat u tego dziecka mutacje prowadziły do tego, że w miejsce aminokwasu pojawiał się kodon terminacji translacji (kodon STOP). Białko zmutowane występowało więc w skróconej formie i było go bardzo mało ze względu na mechanizm „rozkładu nonsensownego mRNA” (nonsense mRNA decay). Komórki umieją rozpoznać kiedy ma powstać skrócone i defektywne białko. To zdarza się również bez mutacji w wyniku np. tak zwanego poślizgu rybosomu. Nie syntetyzują go więc z reguły, bo jest to nie tylko strata energii, ale białka skrócone stanowią również zagrożenie dla komórki. Mogą ulegać w komórkach odkładaniu i przyczyniać się do ich śmierci. Dlatego białko powstające dzięki terapii mogą być immunogenne dla dziecka, więc podawano mu leki immunosupresyjne po zastosowaniu terapii. Więcej o tym zagadnieniu tutaj.

Zastosowanie edycji genomu w terapii – kontekst immunologiczny, Piotr Rieske – Alergologia Polska – Polish Journal of Allergology 4/2021

Naukowcy starali się też unikać modyfikacji genomu poza zmutowanym genem (działań niespecyficznych, off target). Ale nie jest możliwe całkowite wykluczenie takich niechcianych zmian, w DNA niektórych komórek pacjenta, poddawanego takiej terapii.

Terapia u nastolatka z przewlekłą chorobą ziarniniakową

Tym razem zastosowano terapię ex vivo. Właśnie z tego powodu, który wyjaśniono wcześniej. Możliwe było modyfikowanie homeopatycznych komórek macierzystych pozyskanych od pacjenta. Dodatkowo, temu pacjentowi nie groziła śmierć w ciągu kilku miesięcy. Gen NCF1 naprawiany w tym przypadku, koduje białko potrzebne do niszczenia patogenów przez granulocyty (rodzaj białych krwinek) bakterie – p47phox. Ponieważ inne formy obrony prowadzonej przez układ odpornościowy działają, a także dlatego, że lekarze mają do dyspozycji np. antybiotyki chorzy ci żyją coraz dłużej. Około 20% dożywa 35 roku życia. Sytuacja przypominała więc bardziej tą, która ma miejsce w przypadku choroby sierpowatokrwinkowej. Jednak również tu pojawiło się udoskonalenie w porównaniu do terapii zatwierdzonej dla pacjentów z chorobą sierpowatokrwinkową. Zastosowano metodę, która wyewoluowała z CRISPR. Jest to edycja Prime. Metoda ta pozwala uniknąć efektów ubocznych w postaci modyfikacji off target. Mamy do czynienie z zastosowaniem tej techniki po raz pierwszy u pacjenta. Również w przypadku tej mutacji mogą pojawić się problemy opisane wcześniej czyli immunizacja. Mutacja polega bowiem na delecji dwóch sąsiadujących nukleotydów. Nie prowadzi to natychmiast do pojawienia się kodonu STOP. Ale również w tym przypadku pojawia się on przedwcześnie. W przypadku mutacji NCF1 choroba ziarniniakowa jest, także autosomalna recesywna.

Z czego wynika postęp w odniesieniu do innych terapii projektowanych dla pacjentów z chorobami genetycznymi?

Choroba u chłopca (niedobór CPS1) jest przykładem choroby autosomalnej recesywnej – odziedziczenie dwóch uszkodzonych alleli powoduje ewidentne objawy. W przypadku niedoboru CPS1 nie ma właściwie dwójki dzieci z takimi samymi mutacjami. Coś takiego zdarza się praktycznie tylko u rodzeństwa. Niektóre składowe terapii zastosowanej w Filadelfii są więc tak bardzo personalizowane, że raczej nie zostaną użyte u żadnego innego dziecka (pacjenta). Natomiast, samo podejście terapeutyczne, a więc zastosowanie odpowiednich nanolipidów i korekcja dwóch mutacji dzięki szybkim badaniom in vitro i in vivo, najpewniej będzie wykorzystane w terapiach pacjentów z innymi chorobami genetycznymi i udoskonalane. Wiele mutacji jest znanych i tego typu analizy można zaczynać wcześniej. Wiele już było tak analizowane. Co do nanolipidów zastosowanych u tego chorego, to mogą być użyte przynajmniej u chorych, u których zmutowane zostały genu ulegające ekspresji w komórkach wątroby. Udało się wskazać, że CRISPR ABE może mieć przewagi wobec klasycznego CRISPR, w przypadku mutacji takich jak opisane u chłopca z niedoborem CPS1.

Z kolei w przypadku przewlekłej choroby ziarniniakowej chodzi o zastosowanie edycji Prime. Nie było tu konieczności testowania nowej metody dostarczania molekuł terapeutycznych. Więcej sensu miało zastosowanie podejścia sprawdzonego w przypadku choroby sierpowatokrwinkowej – modyfikacji komórek macierzystych ex vivo.

Czy będzie się leczyć na etapie zarodkowym, czy raczej selekcjonować eugenicznie? Przyszłość technologii CRISPR (edycji genomu)

Różne możliwości terapii osób z chorobami genetycznymi. U chłopca z niedoborem CPS1 wykonano terapię in vivo. U nastolatka z przewlekłą chorobą ziarniniakową ex vivo. Terapie (modyfikacje) na etapie życia zarodkowego są w zasadzie zakazane. Taką próbę przeprowadzono w Chinach. Naukowiec został skazany na więzienie. Coraz częściej dopuszcza się natomiast selekcję zarodków, w przypadku chorób genetycznych. Zmieniona rycina pochodzi z: Pełny tekst: Zastosowanie edycji genomu w terapii – kontekst immunologiczny, Piotr Rieske – Alergologia Polska – Polish Journal of Allergology 4/2021

Metody te aktualnie wolno stosować u ludzi na poziomie komórek somatycznych aby leczyć. Nie wolno tak modyfikować embrionów ludzkich. Naukowiec chiński, który twierdził, że podjął taka próbę, aby zabezpieczyć dzieci przed AIDS, został skazany. Problemy prawne naukowca pogłębiło to, że to ojciec był nosicielem, a matka nie. Oczywiście linia obrony była taka, że to mogło się zmienić w trakcie ciąży. Decydujące było ryzyko wynikające z zagrożenia objawami ubocznymi. Chińczycy utajnili jakie były koleje losu tak zmodyfikowanych organizmów ludzkich. Natomiast, Yuval Harari twierdzi, że jest to naturalny kierunek działań człowieka. Porównał nawet zastosowanie edycji genomu do zastosowania viagry. Czyli przejście od leczenia do zwiększania pewnych zdolności. Uważa, że bogaci będą zapewniać to swoim dzieciom i tak dojdzie do powstania nowego podziału w społeczeństwie na „lepszych i gorszych”. „Genetycznie lepsi przejmą jego zdaniem dzięki temu kontrolę nad genetycznie gorszymi”.

Na etapie życia zarodkowego bliżej jest jednak póki co, do zgody na selekcję zarodków, a nie ich leczenie (naprawę genów). W niektórych krajach jak np. Turcja gdzie częściej występuje np. rdzeniowy zanik mięśni (SMA), po wykryciu mutacji u rodziców mogą oni zawierać związki małżeńskie tylko jeśli zgodzą się na posiadanie dzieci po zapłodnieniu in vitro. Według niektórych jest to krok w kierunku wizji przedstawionej w filmie GATTACA – totalitaryzmu eugenicznego. Bardziej negatywny scenariusz, niż zarysowany przez Harariego. Inni uważają, że to lepsze rozwiązania niż terapia po urodzeniu.

Dzieci wzmiankowane w tekście nie przyszłyby na świat, gdyby znano genomy rodziców i zastosowano to podejście. Zastosowanie edycji genomu w celach terapeutycznych, na etapie życia zarodkowego, jest więc nie tylko ryzykowne z powodu możliwych efektów ubocznych (off target), ale również niepraktyczne dlatego, że technicznie istnieje prostsza możliwość. Abstrahuje się tu od kwestii bioetycznych i nie rozważa czy jest to powrót do eugeniki. Natomiast, jeśli brać je pod uwagę to nikt nie godzi się obecnie na to, żeby nasze genomy były znane agencjom rządowym w takim zakresie pod przymusem. W Turcji ze względu na częstość pewnych chorób nie bada się całego genomu ale wybrane geny. W Turcji dopuszczano i dopuszcza się małżeństwa osób spokrewnionych dlatego niektóre choroby autosomalne recesywne występują tam częściej. Ale wiadomo też jakie geny badać. Nikt nie zabrania też sekwencjonowania całych genomów na własny koszt i odpowiedzialność. Specjalizują się w tym Chińczycy. Co jest również przedmiotem obiekcji niektórych środowisk naukowych. Ostrzegają przed tym również kolejne rządy np. w USA. Niekiedy staje się to wręcz przedmiotem teorii spiskowych. RFK jr insynuował, że dzięki temu Chińczycy zaprojektowali SARS-CoV-2 tak, żeby atakował tylko wybrane populacje. Niemniej pewne zagrożenie istnieje. Tego typu obiekcji istnieje oczywiście więcej.

Pierwsze co określa się jako dopuszczalne u ludzi, a wychodzi niekiedy poza terapie, to tworzenie genetycznie poprawionych/zmodyfikowanych mikroorganizmów (GMM), które nas kolonizują. Czyli zmodyfikowanych bakterii jelitowych, o których wpływie na zdrowie człowieka wiadomo coraz więcej.

Technologia CRIPSR znajdzie więc zastosowanie raczej w terapii somatycznej. Natomiast, jeśli chodzi o modyfikacje zarodków to będzie to możliwe przez wiele tylko u zwierząt (poprawa), a dopiero później ludzi, o ile w ogóle tak się stanie.

Technologia CRISPR została krótko opisana dla „Eksperymentu myślowego” tutaj:

https://eksperymentmyslowy.pl/tag/inzynieria-genetyczna

Linki do artykułu głównego opisującego terapię.

https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa2504747

Komentarz w Nature.

https://www.nature.com/articles/d41586-025-01496-z

Relacja rodziców chłopca

A Breakthrough in Medicine: Personalized Gene Editing to Save KJ