Wysoko w Andach (2): nanociała, czyli jak lamy pomagają w diagnostyce i terapii

Lamy i przeciwciała

W poprzednim odcinku pisałem, jak lamy przystosowały się do życia na dużych wysokościach. Ale chyba najciekawszą cechą wielbłądowatych są ich przeciwciała. Przeciwciała są białkami produkowanymi przez komórki układu odpornościowego, których główną rolą jest rozpoznawanie cząsteczek wchodzących w skład wirusów, bakterii albo grzybów, czyli ogólnie mówiąc patogenów. Jeżeli przeciwciało rozpozna coś obcego na powierzchni patogenu (np. białko albo wielocukier), to wiąże się do tej obcej cząsteczki. Obce formy życia z przyłączonymi przeciwciałami są rozpoznawane przez wyspecjalizowane komórki układu odpornościowego (np. makrofagi) i niszczone.

Przeciwciała są elementem odporności adaptacyjnej, która jest cechą wszystkich kręgowców. Polega na tym, że komórki układu odpornościowego generują białka odpornościowe (takie jak przeciwciała), które są kodowane nie przez pojedyncze geny, ale przez zestawy segmentów genowych. Z tych segmentów w wyniku rearanżacji (którą można też nazwać tasowaniem) powstaje końcowy gen kodujący białko (w tym przypadku zmienny fragment przeciwciała). Ponieważ segmentów genowych może być kilkaset, to liczba kombinacji jest w zasadzie nieskończona. W przypadku przeciwciał szacuje się ją na 1011. Tak więc jest niezwykle mało prawdopodobne, żeby nasz układ odpornościowy napotkał patogen, którego nie jest w stanie rozpoznać. A że czasem napotyka, w wyniku czego chorujemy czy nawet umieramy? Niestety, nic nie jest doskonałe, nawet nasz układ odpornościowy. Ale przeważnie radzi sobie z infekcjami całkiem nieźle.

Przeciwciała kręgowców (z nielicznymi wyjątkami) składają się z dwóch rodzajów łańcuchów białkowych: ciężkich i lekkich. Nazwa pochodzi od masy cząsteczkowej obu łańcuchów: ciężki łańcuch to ok. 50 000 Da, lekki to ok. 25 000 Da. Oba łańcuchy są połączone z sobą mostkami disiarczkowymi (czyli grupami S-S w resztach cystein). Ponadto, we wszystkich przeciwciałach łańcuchy ciężkie i lekkie są dwa (Ryc. 1).

W ciężkim łańcuchu można wyróżnić cztery domeny; VH, CH1, CH2 i CH3, a w lekkim dwie: VL i CL. Antygen jest rozpoznawany przez miejsce wiążące antygen (complementarity determining region, CDR), które wchodzi w skład domen VH i VL. To właśnie domeny VH i VL, nazywane fragmentami zmiennymi, są kodowane przez geny powstałe w wyniku rearanżacji segmentów genowych. Ta część przeciwciała jest najbardziej zróżnicowana. I właśnie dlatego miejsce wiążące antygen może mieć tyle różnych struktur. Właśnie dlatego liczba przeciwciał o różnej sekwencji, czyli rozpoznających różne rodzaje antygenów, może przekraczać 1011.

Pozostałe domeny (CH1, CH2, CH3 i CL) są takie same we wszystkich przeciwciałach danej klasy, i dlatego nazywane są fragmentami stałymi.

Ryc. 1. Schemat przeciwciała klasy IgG wraz z ciężkim łańcuchem (fioletowy) i lekkim łańcuchem (amarantowy). Zaznaczono fragmenty zmienne: VH i VL, oraz fragmenty stałe: CH1, CH2, CH3 i CL. Created with BioRender.com.

Czy lekkie łańcuchy są konieczne?

Tak więc wydawałoby się, że obecność obu łańcuchów, czyli ciężkiego i lekkiego, jest niezbędna, aby przeciwciała mogły wykonywać swoje funkcje. A ta funkcja to rozpoznawanie obcych cząsteczek, obecnych np. na patogenach. Chociaż pyłki traw patogenami nie są, a przeciwciała je rozpoznają, często z niedobrym skutkiem dla nas. Ale to temat na osobny artykuł o alergii. U pewnej grupy kręgowców istnieją jednak przeciwciała składające się wyłącznie z ciężkich łańcuchów, czyli tzw. przeciwciała ciężkołańcuchowe. To rodzina wielbłądowatych, czyli wielbłądy i lamy.

Część przeciwciał u wielbłądowatych nie ma lekkich łańcuchów, czyli składa się wyłącznie z pary ciężkich łańcuchów (Ryc. 2B). Domena VH, która wraz z domeną VL tworzy miejsce wiążące antygen, jest więc jakby pozbawiona swojej drugiej połowy. Ale paradoksalnie nie ma to wpływu na zdolność rozpoznawania obcych cząsteczek przez te przeciwciała. Domena VH u wielbłądowatych jest wprawdzie trochę dłuższa niż u innych kręgowców (nazywa się ją domeną VHH), ale poza tym takie przeciwciała rozpoznają obce antygeny równie dobrze, co przeciwciała składające się z lekkich i ciężkich łańcuchów. Dlaczego tak jest?

Ryc. 2. Klasyczne (A) i ciężkołańcuchowe przeciwciało (B). Pokazano regiony, fragment Fab (Antigen binding site, fragment wiążący antygen), fragment Fc oraz region zawiasowy (Hinge). Autor: Dorota Smolarek.

Splajsing (splicing), czyli wycinanie sekwencji niekodujących

Brak lekkich łańcuchów jest pośrednim skutkiem mutacji w tzw. miejscu splajsingowym. Tu trzeba wyjaśnić, że geny u organizmów eukariotycznych (czyli innych niż bakterie) składają się na ogół z fragmentów kodujących białko, nazywanych eksonami, i fragmentów niekodujących, nazywanych intronami. Kiedy w wyniku transkrypcji genu powstaje mRNA, to zawiera jeszcze wszystkie introny. Proces nazywany splajsingiem (polska nazwa: zespalanie składowych jakoś się nie przyjęła) powoduje, że introny zostają wycięte. W ten sposób pre-mRNA, czyli RNA, które powstało w wyniku transkrypcji, zmienia się w „dojrzałe” mRNA, które zostaje matrycą w syntezie białka (czyli w translacji). Za rozpoznawanie i wycinanie intronów odpowiada kompleks ok. 200 białek nazywany splajsosomem. To on rozpoznaje w pre-mRNA sekwencje nukleotydowe nazywane miejscami splajsingowymi, które znajdują się na styku intronów i eksonów (Ryc. 3).

Ryc. 3. Splajsing polega na wycinaniu z pre-mRNA intronów, czyli fragmentów, które nie kodują białka. Po wycięciu intronów mRNA zawiera tylko eksony. Created with BioRender.com.

Mutacja u lam i wielbłądów

Wielbłądowate, podobnie jak inne kręgowce, mają trzy podklasy przeciwciał IgG: IgG1, IgG2 i IgG3. O ile IgG1 mają „klasyczną”, dwułańcuchową budowę, to IgG2 i IgG3 składają się tylko z ciężkich łańcuchów. Lekkich łańcuchów nie ma w ogóle. Dlaczego tak jest? Przyczyną jest mutacja w jednym z miejsc splasingowych genu kodującego ciężki łańcuch. Zastąpienie guaniny przez adeninę na styku eksonu CH1 i intronu powoduje, że splajsosom nie rozpoznaje miejsca splajsingowego. Dlatego wycina ekson CH1 wraz z okalającymi intronami. Powstałe w ten sposób mRNA zawiera sekwencje kodujące regiony: VH (nazywane w tym przypadku VHH), CH2 i CH3, ale nie ma sekwencji kodującej region CH1 (Ryc. 4).

Ryc. 4. Mutacja jednego nukleotydu w miejscu splajsingowym na granicy eksonu CH1 i intronu powoduje wycięcie tego eksonu wraz z intronami. Dotyczy to genów kodujących przeciwciała klasy IgG2 i IgG3 u wielbłądów i lam. Autor: Dorota Smolarek.

No dobrze, ale w sumie to ciężki łańcuch ma defekt, a nie lekki. To dlaczego lekkiego łańcucha brakuje?

Białko BiP wchodzi do gry

Białka wydzielane na zewnątrz komórki powstają w siateczce śródplazmatycznej, nazywanej też retikulum endoplazmatycznym. Jest to coś w rodzaju wewnętrznej struktury komórki składającej się z małych pęcherzyków. Większość białek wydzielanych przez komórki powstaje właśnie tam. Należą też do nich też przeciwciała. Ale z nimi jest jeden problem. Składają się z dwóch łańcuchów ciężkich i dwóch lekkich (mówimy o przeciwciałach klasy IgG, bo są jeszcze inne rodzaje przeciwciał). Przeciwciała składające się tylko z jednego rodzaju łańcucha nie powinny być wydzielane, bo pojedynczy ciężki lub lekki łańcuch nie jest w stanie związać żadnego antygenu. Z reguły jest więc tak, że ciężki łańcuch pozostaje w siateczce śródplazmatycznej tak długo, aż lekki łańcuch się nie przyłączy. Takim „hamulcowym” jest białko BiP (nazwa pochodzi od Heavy Chain Binding Protein, czyli białko wiążące ciężki łańcuch). Jeżeli ciężki łańcuch pozostanie w siateczce śródplazmatycznej przez jakiś czas, to będzie sugerowało, że nie napotkał partnera w postaci lekkiego łańcucha. Wtedy białko BiP kieruje go do proteasomu, który jest czymś w rodzaju niszczarki białek. Dlatego żaden zdrowy kręgowiec nie produkuje ciężkich łańcuchów „luzem”. Wyjątkiem są wielbłądowate, a także rekiny. Lekkich łańcuchów powstaje zawsze mniej niż ciężkich, więc każdy lekki łańcuch znajdzie swojego partnera (Ryc. 5).

Ryc. 5. A. Produkcja przeciwciał „klasycznych” w siateczce śródplazmatycznej. Białko BiP wiąże się do regionu CH1 i zatrzymuje ciężki łańcuch do czasu związania z łańcuchem lekkim. Jeżeli ciężki łańcuch nie znajdzie partnera (czyli łańcucha lekkiego) jest wiązane przez kompleks E3 (ligaza ubikwitynowa) i degradowane w proteasomie. B. Przeciwciała produkowane przez przedstawicieli wielbłądowatych nie mają regionu CH1, więc białko BiP nie ma się do czego związać. Ciężkie łańcuchy są wydzielane, a lekkie zaniknęły jako niepotrzebne. Autor: Dorota Smolarek.

Ewolucja przeciwciał u lam i wielbłądów

Kiedy miała miejsce mutacja powodująca brak regionu CH1? Wielbłądokształtne (Tylopoda) oddzieliły się od innych parzystokopytnych ok. 60 milionów lat temu, a wielbłądowate zróżnicowały się na wielbłądy i lamy ok. 11 milionów lat temu. Uważa się, że kluczowa mutacja zaszła ok. 25 milionów lat temu, bo występuje zarówno u wielbłądów, jak i lam. Początkowo zapewne te pojedyncze ciężkie łańcuchy nie wiązały żadnych antygenów, ale presja ewolucyjna spowodowała, że geny kodujące te przeciwciała zmieniły się, i lekki łańcuch nie był już dłużej potrzebny. Fragment VHH, czyli ten, który odpowiada za rozpoznanie antygenu, jest u wielbłądowatych trochę dłuższy niż „klasyczny” VH, ale poza tym nie ma dużych różnic.

Tak więc pojedyncza mutacja spowodowała powstanie całkiem nowej klasy białek. Ciekawe, że chociaż wskutek tej mutacji powstało prawdopodobnie początkowo nieaktywne białko, to mutacja nie zaniknęła, ale rozpowszechniła się. I dziś jest obecna u wszystkich wielbłądowatych. Ponieważ produkcja białek jest kosztowna energetycznie (potrzebne są 4 cząsteczki ATP na każde wiązanie peptydowe, czyli połączenie dwóch reszt aminokwasowych), to w zasadzie i inne organizmy mogłyby zaoszczędzić i pozbyć się lekkich łańcuchów. Tak się jednak nie stało. Dlaczego? Nie ma łatwej odpowiedzi. Richard Dawkins powiedziałby, że tak właśnie działa ślepy zegarmistrz.

VHH jako nadzieja medycyny?

Przeciwciała ciężkołańcuchowe, a przede wszystkim ich fragmenty VHH, to najmniejsze podjednostki przeciwciał mogące swoiście rozpoznać antygeny. Można je otrzymać szczepiąc  lamy lub wielbłądy odpowiednim białkiem (lamy są łatwiejsze w hodowli od wielbładów, więc to przeważnie lamy stanowią „źródło” przeciwciał). Następnie za pomocą metody biologii molekularnej (a to temat na osobny artykuł) otrzymuje się DNA kodujące fragmenty VHH, które rozpoznają białko użyte do szczepienia. Mogą być one produkowane przez bakterie Escherichia coli, które należą do organizmów najczęściej wykorzystywanych do produkcji białek. Można produkować fragmenty VHH w wersji pojedynczej, dwuwartościowej lub dwuswoistej. Mogą też być związane z enzymami, toksynami lub innymi cząsteczkami (Ryc. 6).

Ryc. 6. Nanociała, czyli fragmenty ciężkołańcuchowych przeciwciał (VHH). Nanociała mogą być dwuwartościowe, dwuswoiste, lub połączone z enzymami lub toksynami. Autor: Dorota Smolarek.

Takie fragmenty VHH, zwane też nanociałami (nanobodies) są dziś coraz szerzej stosowane w medycynie. Mają liczne zalety w porównaniu z „klasycznymi” przeciwciałami. Są znacznie mniejsze, więc na ogół nie powodują reakcji układu odpornościowego u osoby, której je się wstrzyknie. Łatwiej nimi manipulować,  ponieważ składają się z jednego łańcucha białkowego. Można je łatwo produkować w bakteriach. Są stabilne, także w wysokich temperaturach, i mają wysokie powinowactwo wobec antygenu.

Są już stosowane w diagnostyce, np. do wykrywania wirusów (w tym SARS-CoV-2) lub toksyn bakteryjnych. W połączeniu z radioaktywnymi izotopami są stosowane w diagnostyce nowotworów, np. do wykrywania antygenów nowotworowych, takich jak HER2 w raku piersi lub CEA w raku jelita grubego. Mogą też neutralizować toksyny, np. toksynę skorpiona Androctonus australis, która należy do najbardziej zabójczych (LD50 dla myszy to 0,32 mg/kg masy ciała).

Nanociało o nazwie Cablivi (caplacizumab), produkowane przez belgijską firmę Ablynx, zostało zatwierdzone w terapii zakrzepowej plamicy małopłytkowej (thrombotic thrombocytopenic purpura, aTTP). W tej chorobie zakrzepy z płytek krwi w małych naczyniach krwionośnych powodują lokalne zatrzymanie krążenia, co może prowadzić od niewydolności nerek i uszkodzenia mózgu.

Ale największe nadzieje budzi zastosowanie nanociał w terapii celowanej w chorobach nowotworowych. Co najmniej 12 takich cząsteczek otrzymanych w lamach jest obecnie w różnych fazach badań klinicznych (Ryc. 7).

Ryc. 7. Nanociało (VHH) ropoznające nowotworowy antygen CEA połączone z enzymem, który generuje toksynę niszczącą komórkę nowotworową. Autor: Dorota Smolarek.

Literatura dodatkowa

Przeciwciała u wielbłądowatych

https://phmd.pl/resources/html/article/details?id=6538&language=pl

Nanociała w medycynie

https://phmd.pl/resources/html/article/details?id=55101&language=en

https://www.science.org/content/article/mini-antibodies-discovered-sharks-and-camels-could-lead-drugs-cancer-and-other-diseases

https://www.mdpi.com/1422-0067/24/4/4176

https://www.mdpi.com/1422-0067/23/9/5009

3 thoughts on “Wysoko w Andach (2): nanociała, czyli jak lamy pomagają w diagnostyce i terapii

  1. A czy wielbłądowate mają jakąś korzyść z tych specyficznych przeciwciał? Są bardziej odporne niż reszta kręgowców? A może tylko na jakieś konkretne choroby (lub kategorie chorób)?

  2. Wydaje się, że nie ma żadnych różnic miedzy wielbłądowatymi i resztą kręgowców jeżeli chodzi o odporność. Czyli my (ta reszta) moglibyśmy się obejść bez lekkich łańcuchów w przeciwciałach, ale jakoś u nas mutacja nie zaszła i zostaliśmy z nimi jak Himilsbach z angielskim:).

    1

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany. Wymagane pola są oznaczone *